本文属于类型a，即单项原始研究报告。以下是对该研究的学术报告。
本研究由芬兰赫尔辛基大学药学院药理学与药物治疗学部的Jinhan Nam、Merja H. Voutilainen以及美国巴尔的摩国家药物滥用研究所校内研究项目的Christopher T. Richie、Brandon K. Harvey共同完成，其中Merja H. Voutilainen为通讯作者。该论文发表于《Scientific Reports》杂志，文章于2023年7月13日收到，2024年6月24日接受，发表于2024年第14卷，文章编号16487。
本研究的学术背景为帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的疾病修饰治疗研究。帕金森病是一种以黑质纹状体多巴胺能通路进行性退变为特征的神经退行性疾病，患者表现为运动迟缓、强直、静止性震颤、步态障碍等运动症状以及胃肠功能障碍、睡眠障碍和抑郁等非运动症状。目前帕金森病的治疗主要以对症治疗为主，尚缺乏能够阻止或延缓疾病进展的疾病修饰疗法。脑多巴胺神经营养因子（cerebral dopamine neurotrophic factor, CDNF）及其结构同源蛋白中脑星形胶质细胞来源神经营养因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF）是两类具有神经营养特性的蛋白质。已有研究表明，CDNF在啮齿类和非人灵长类帕金森病毒素模型中能够保护和恢复多巴胺神经元功能，并在1/2期临床试验中表现出一定安全性和治疗效果。然而，CDNF发挥神经营养活性的具体机制尚不明确。CDNF的C末端具有内质网滞留信号序列KTEL，提示其可能参与内质网应激和未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）的调控。基于此，本研究旨在通过腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体将人CDNF（human CDNF, hCDNF）递送至急性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP）小鼠帕金森病模型脑内，评价其神经营养作用，并重点探讨CDNF是否通过调控神经炎症和UPR通路发挥神经保护效应。
研究流程主要分为两大阶段。第一阶段为AAV载体表达特性和毒性评估。研究采用C57BL/6雄性小鼠，通过立体定位手术将AAV血清型1载体AAV-hCDNF、对照载体AAV-GFP或磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）双侧注射至纹状体（striatum, STR）。AAV-GFP载体中的GFP蛋白C末端带有与CDNF相同的THPKTEL序列，使其同样定位于内质网腔，以排除内质网定位本身带来的影响。注射后2周和6周，通过免疫组织化学染色和Western blot检测转基因表达。结果显示，GFP和hCDNF在纹状体和黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）均有表达，且与内质网标志物GRP78共定位。hCDNF在TH阳性多巴胺能纤维和GFAP阳性星形胶质细胞中表达，但不在IBA1阳性小胶质细胞中表达。此外，AAV-hCDNF和AAV-GFP注射后均未引起纹状体TH和DAT免疫反应性以及黑质TH阳性神经元数量的显著改变，表明该剂量下无明显毒性。
第二阶段为AAV-hCDNF对急性MPTP小鼠模型的行为学、组织学和分子生物学效应评估。实验方案为：小鼠先接受双侧纹状体AAV-GFP、AAV-hCDNF或PBS注射，4周后腹腔注射MPTP（20 mg/kg，每2小时一次，共4次）建立急性帕金森病模型。MPTP注射后5至6天进行行为学测试，7天后处死小鼠进行组织学和生化分析。行为学测试包括转棒实验、衣架实验、旷场实验和步态分析。结果显示，MPTP处理导致小鼠在转棒实验中的掉落潜伏期缩短，而AAV-hCDNF处理显著改善了这一运动协调障碍。在衣架实验中，AAV-hCDNF处理组小鼠的运动评分显著高于PBS+MPTP组和AAV-GFP+MPTP组，表明前肢力量和运动协调性得到改善。但AAV-hCDNF未显著改变衣架悬挂时间和到达斜杆边缘的时间。旷场实验中各组运动距离和垂直站立次数无显著差异。步态分析中，AAV-hCDNF改善了MPTP引起的前肢步幅长度变异性的降低，但其他步态参数无显著差异。
组织学分析表明，MPTP处理导致纹状体TH和DAT阳性纤维密度以及黑质TH阳性神经元数量显著下降。AAV-hCDNF处理组的DAT阳性纤维密度、TH阳性纤维密度和TH阳性神经元数量均显著高于PBS+MPTP组和AAV-GFP+MPTP组，Western blot进一步验证了TH蛋白水平的保护效应。在神经炎症方面，研究通过免疫荧光双标记检测了IBA1与IL-1β、GFAP与IL-1β、GFAP与C3的共定位。结果显示，MPTP处理增加了纹状体和黑质中小胶质细胞和星形胶质细胞来源的IL-1β表达，而AAV-hCDNF显著降低了这些共定位面积。Western blot也显示AAV-hCDNF降低了前体和成熟形式的IL-1β水平。此外，MPTP处理后小胶质细胞分支长度显著增加，而AAV-hCDNF使分支长度恢复正常。在星形胶质细胞A1极化方面，MPTP增加了GFAP与C3的共定位，AAV-hCDNF显著减少了该共定位面积。在UPR通路方面，MPTP处理增加了星形胶质细胞中GRP78和CHOP的免疫反应性，AAV-hCDNF处理显著降低了GRP78与GFAP以及CHOP与GFAP的共定位面积。Western blot检测GRP78和CHOP总蛋白水平时，组间差异未达到统计学显著性，可能与取样时间点为MPTP处理后7天、胶质激活高峰已过有关。
本研究的结论是，AAV介导的hCDNF递送在急性MPTP小鼠帕金森病模型中具有神经保护作用，能够改善运动功能并减轻黑质纹状体多巴胺能通路的退变。其机制可能至少部分通过调节神经炎症和UPR通路实现。具体而言，hCDNF降低了小胶质细胞和星形胶质细胞中促炎细胞因子IL-1β以及A1星形胶质细胞标志物C3的表达，并减少了星形胶质细胞中内质网应激标志物GRP78和CHOP的表达。本研究的科学价值在于：首次在急性MPTP小鼠模型中验证了AAV-hCDNF基因治疗的有效性，并为CDNF通过调控胶质细胞介导的神经炎症和UPR通路发挥神经保护作用提供了新的体内证据。在应用价值方面，该研究支持CDNF作为帕金森病疾病修饰治疗的候选分子，AAV介导的CDNF基因递送策略可能为临床治疗提供一种新的思路。
本研究的亮点主要包括：第一，使用了带有内质网滞留序列KTEL的GFP作为对照载体，使其与CDNF具有相同的细胞内定位，从而更准确地排除内质网定位本身带来的非特异性效应。第二，同时从神经炎症和UPR通路两个角度探讨了CDNF的作用机制，并将研究焦点集中在胶质细胞而非神经元上。第三，行为学评估中引入了步态分析，尝试从步态动力学角度评价CDNF的改善效果。此外，研究还通过小胶质细胞形态学分析证实AAV-hCDNF能够使MPTP引起的小胶质细胞分支增长恢复正常，这为CDNF调节小胶质细胞激活状态提供了形态学证据。