本文作者为Shunzhou Wan、Xibei Zhang、Xiao Xue与Peter V. Coveney，其中Shunzhou Wan与Xibei Zhang为共同第一作者，Peter V. Coveney为通讯作者。研究机构为伦敦大学学院（University College London）计算科学中心（Centre for Computational Science）及高等研究计算中心（Advanced Research Computing Centre）。论文发表于*Journal of Chemical Theory and Computation*，2026年7月29日在线发表，卷号为22，页码7811−7824。
该研究属于计算药物发现与人工智能辅助分子建模交叉领域。尽管人工智能在药物发现领域被广泛宣传，但目前仍未有“AI发现药物”获得监管批准。Boltz-2是近期发布的生物分子基础模型（foundation model），其目标是弥合人工智能效率与基于物理学的精度之间的差距，通过联合“共折叠”（cofolding）方法同时预测蛋白质-配体复合物结构及结合亲和力。该模型声称其结合亲和力预测精度可接近自由能微扰（free energy perturbation，FEP）水平，同时计算速度快数个数量级。然而，Boltz-2在大规模、靶点特异性化学库中的表现尚未经过严格的物理学基准验证。因此，本研究旨在系统评估Boltz-2的结构预测与结合亲和力预测能力，重点考察其是否可作为虚拟筛选阶段中基于物理学流程的可靠高通量替代方案。
研究使用了两个大规模数据集：针对SARS-CoV-2主蛋白酶（3CLpro）的16780个化合物和针对端锚聚合酶2（TNKS2）的21702个化合物。研究流程分为四个主要部分。第一部分是数据集准备。3CLpro数据集最初约10000个化合物，从ZINC15和Mcule化合物数据库中通过替代对接模型筛选获得；TNKS2数据集由生成式分子人工智能REINVENT基于27个已知活性化合物生成。随后通过生成式主动学习（generative active learning，GAL）迭代优化，使用ESMACS预测结合亲和力作为评分函数，最终分别得到约16900和21861个化合物。去除分子动力学模拟或自由能计算中执行错误的化合物后，最终数据集规模分别为16780和21702。此外，研究还从BindingDB数据库提取了具有实验结合数据的化合物用于独立验证，其中3CLpro有59个，TNKS2有1137个。由于Boltz-2训练数据截止于2023年6月，研究将实验数据按截止日期前后分为B1和B2两组分别评估。第二部分是Boltz-2推理与结构预测。对每个配体，模型输入蛋白质序列和配体SMILES字符串，使用默认预训练权重，不加空间约束。预测结果为连续结合亲和力分数（以log10(IC50)表示）和最高置信度的三维原子坐标。推理在英国布里斯托大学的Isambard-AI超级计算机上完成，使用NVIDIA GH200 GPU。单个化合物推理耗时约77秒（3CLpro）和74秒（TNKS2）。第三部分是ESMACS自由能计算。初始全数据集的结合自由能来自前期研究中的粗粒度ESMACS（CG-ESMACS）方案，使用10个副本（replica）和10 Å缓冲距离。为进一步评估Boltz-2在先导化合物优化中的精度，研究选取Boltz-2预测排名前100的化合物进行精细ESMACS（FG-ESMACS）计算。每个复合物使用25个副本、每个副本10纳秒生产运行，总计每个化合物250纳秒采样。FG-ESMACS分别从三种初始结构出发：传统对接结构、直接加氢的Boltz-2结构、根据SMILES校正氢位置的Boltz-2结构。分子动力学模拟使用NAMD引擎和AMBER力场，自由能计算使用AmberTools。全部FG-ESMACS模拟在橡树岭国家实验室的Frontier超算上完成，5000个独立运行并发执行，3CLpro和TNKS2分别用时112分钟和101分钟。第四部分是结构与能量评估指标。结构比较使用全局均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）和局部距离差异测试（local distance difference test，LDDT）。能量比较使用皮尔逊相关系数（Pearson correlation coefficient）和斯皮尔曼等级相关系数（Spearman’s rank correlation）。
结构分析结果显示，对于3CLpro，Boltz-2预测的蛋白质结构与X射线结构（PDB ID: 6W63）高度接近，RMSD约0.4 Å；而TNKS2的蛋白质构象存在显著变异，RMSD分布出现多个峰，主峰集中在1.0 Å，部分延伸至约1.8 Å。配体结合位置比较显示，3CLpro的配体RMSD分布范围广泛，主峰低于10 Å，同时存在22–50 Å的平台区；TNKS2的配体RMSD呈双峰分布，两峰均低于10 Å，表明Boltz-2对TNKS2的结构预测准确度高于3CLpro。LDDT分析进一步表明，3CLpro中约11.3%的配体LDDT值超过6 Å，说明Boltz-2预测的部分配体结合位点与天然位点显著偏离，存在多个替代结合位点。TNKS2则大部分配体位于X射线结构确定的结合位点内或邻近区域，仅个别配体结合于完全不同的位点。Boltz-2内部置信度分数分析显示，两个系统的置信度分数均高度压缩，所有配体得分均高于0.8，且均值分别为0.946和0.944。当阈值提高至0.95时，3CLpro有55.35%的配体超过该阈值，而TNKS2仅有42.46%；当阈值提高至0.97时，TNKS2仅剩4.38%。这表明Boltz-2的内部不确定性估计存在靶点依赖性，且在常规阈值范围内区分能力有限。
结合亲和力评估结果显示，Boltz-2与ESMACS之间的全局相关性弱至中等。对于TNKS2，皮尔逊相关系数为0.45，斯皮尔曼等级相关系数为0.46；对于3CLpro，两者分别为0.24和0.25。Boltz-2预测的结合亲和力与结合概率之间的相关性也很弱，分别为0.21和0.25，表明模型的多目标架构存在不一致性。Boltz-2的可重复性评估显示，两次独立推理之间的皮尔逊相关系数为0.913（3CLpro）和0.962（TNKS2），斯皮尔曼等级相关系数分别为0.897和0.954，但绝对差值可达约1.5 kcal/mol，足以改变先导化合物优先级。
针对前100名化合物的精细分析中，Boltz-2与ESMACS所选化合物重叠极小，3CLpro仅有2个共同化合物，TNKS2仅有1个。统计表明，在如此规模的数据集中，随机出现至少一个共同化合物的概率分别为45.0%和36.9%，说明两种评分方法探索的化学空间区域根本不同。在前100名化合物中，Boltz-2预测与FG-ESMACS计算结果完全不相关，皮尔逊和斯皮尔曼相关系数均接近零。进一步分析发现，Boltz-2预测的配体结构存在系统性的饱和状态错误：28个3CLpro化合物和30个TNKS2化合物在环系中倾向于增加不饱和度，例如将吡咯烷基预测为吡咯基；而在脂肪链中则倾向增加饱和度。研究推测这种偏差源于模型训练数据中隐含的能量景观偏好。两种不同初始结构的ESMACS计算（Boltz-2结构与对接结构）之间呈现中等正相关，相关系数约0.45至0.60，并且对于Boltz-2结构启动的ESMACS，校正饱和状态后的能量较对接结构更不利，说明对接结构可能更具可靠性。
在BindingDB实验验证部分，TNKS2系统中Boltz-2与实验测量值的相关系数达到0.77，而ESMACS仅为0.23。然而，作者强调这一高相关性可能源于模型记忆而非真实泛化。通过t-SNE化学空间投影分析发现，BindingDB中的实验化合物占据高度局域且狭窄的化学空间区域，训练截止日期之后新增的B2化合物与历史B1化合物在化学空间上高度重叠。此外，对271个具有多个实验测量值的TNKS2化合物进行10000次自助抽样（bootstrapping）分析，发现实验数据之间的平均皮尔逊相关系数仅为0.56，标准差为0.25，表明公共数据库中实验数据本身存在严重异质性。最极端情况下，同一配体在不同实验室报告的TNKS2结合自由能差异可达5.1 kcal/mol，对应IC50或Ki约3.7至4个数量级的偏移。因此，作者认为Boltz-2的高相关性可能是拟合了实验噪声而非真实生物信号。
研究结论指出，Boltz-2虽然能够高效生成蛋白质-配体复合物，但在结合亲和力排序方面表现不佳，不能作为药物发现后期阶段中基于物理学方法的可靠替代品。结构层面，Boltz-2能够捕捉更广泛的构象集合，但无法一致地识别单一主导的天然结合位点。能量层面，其在全局评估中仅呈现弱至中等相关性，在前100名化合物的精细分析中完全失去相关性。根本原因在于当前机器学习架构依赖平滑可微的统计模式，而真实化学空间中的构效关系（structure–activity relationships，SARs）往往是不连续的，典型表现如“活性悬崖”（activity cliff）。Boltz-2的饱和状态错误进一步说明模型无法准确预测部分配体的结合姿态，进而影响基于结构预测的结合亲和力可靠性。作者强调，在大规模数据集中，虚假相关与真实相关的比例随数据量增大呈组合式增长，因此必须引入物理学理解以甄别真实相关。在基础模型能够超越这些数学伪影并结合物理学相互作用及不确定性量化之前，它们仍不足以在真实化学空间的复杂活性悬崖中导航。
该研究的核心价值在于以大规模、多靶点、基于物理学自由能计算的高精度基准，系统揭示了当前领先AI基础模型在药物发现关键环节的根本性局限。其特色在于将AI预测与基于系综的增强采样分子动力学方法ESMACS进行直接对比，覆盖数万化合物的全局分析和对前100命中的高精度验证，同时通过时间分割和化学空间投影区分了真实泛化与模型记忆。这一工作对于计算药物发现领域的研究者在使用AI模型进行先导化合物识别和优化时具有重要的警示和参考意义。