骨髓间充质谱系细胞是参与骨稳态和骨质疏松等疾病的一类异质性细胞群。虽然长期以来人们推测它们起源于间充质干细胞，但其祖细胞的真实身份及其在体内分化为成骨细胞和脂肪细胞的异化路径仍知之甚少。本研究由Ling Qin团队主导，包括第一作者Leilei Zhong以及来自宾夕法尼亚大学、华中科技大学、中国医科大学第一医院等机构的众多合作者，于2020年4月14日发表在eLife期刊上，论文标题为“单细胞转录组学鉴定出一个调控骨髓环境的独特脂肪谱系细胞群”。本研究旨在利用大规模单细胞转录组测序技术，在分子层面解析骨髓内间充质祖细胞的体内分化路径，并鉴定新的细胞亚群及其功能。

学术背景：骨髓不仅是造血发生的场所，也是骨骼系统的重要组成部分。骨髓中的间充质谱系细胞（Mesenchymal Lineage Cells）具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的双向潜能，这一平衡的失调与骨质疏松等骨骼疾病密切相关。骨质疏松症的特征是骨质过度流失和结构恶化，常伴随骨髓脂肪含量的增加。因此，理解骨髓间充质干细胞（MSCs）的身份及其向成骨和成脂分化的体内路径是骨研究的核心。然而，与人们对造血干细胞（HSCs）分化过程的深入了解相比，对MSCs及其后代在体内的认知极不完整，这极大地限制了治疗骨丢失相关临床疾病的进展。以往的研究依赖于体外培养和特定的谱系示踪技术，但这些方法要么改变了细胞所处的微环境，要么无法精确反映细胞分化的动态阶段。近年来发展的大规模单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为在体内无偏倚地研究骨髓间充质细胞提供了强大工具。本研究即利用此技术，结合特定的遗传学小鼠模型，旨在描绘骨髓间充质祖细胞的体内分化图谱，并揭示新的细胞类型和功能。

详细工作流程：本研究是一个系统性工程，包含了多个相互关联的实验步骤和数据分析流程，主要可分为以下几个阶段： 1. 模型构建与细胞分选：研究团队利用了一种先前报道的Col2-Cre; Rosa26-lsl-tdTomato (Col2:td)小鼠模型。该模型中，tdTomato（td）荧光蛋白标记了所有骨髓间充质谱系细胞，包括每个骨细胞、每个骨髓脂肪细胞以及所有能形成成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）的细胞。这确保了单细胞测序能覆盖所有相关的间充质祖细胞。研究人员从1月龄、3月龄和16月龄的Col2:td小鼠股骨和胫骨中，采用一种特殊的酶消化方法获取了位于骨小梁内的骨内膜骨髓细胞，这种方法比传统的骨髓冲洗法能更好地保留间充质祖细胞和成骨细胞。通过流式细胞术，他们分选了骨髓细胞中td荧光强度最高的前1%的细胞，因为实验证实这部分细胞包含了几乎所有的CFU-F形成细胞（即间充质祖细胞）以及成骨细胞。 2. 大规模单细胞转录组测序：使用10x Genomics平台，研究人员对来自不同年龄段（1/1.5月龄、3月龄、16月龄）小鼠的上述分选细胞进行了单细胞RNA测序。每个年龄组都获得了数千个高质量细胞的转录组数据。例如，从1-1.5月龄小鼠中获得了13,759个细胞的数据，中位基因数达2686个/细胞。原始数据处理使用Cell Ranger软件进行，包括测序数据的解复用、比对到小鼠基因组（mm10）以及基因表达矩阵的生成。 3. 计算分析与细胞聚类：利用Seurat软件包（v2和v3）对表达数据进行质量控制、归一化、降维和聚类分析。他们首先在所有细胞中识别出间充质谱系、造血细胞、内皮细胞和周细胞等大类。然后，专门对间充质谱系细胞进行亚聚类分析。通过t-SNE和UMAP等可视化方法，成功地将间充质谱系细胞划分为9个亚群。这些亚群根据已知的标志基因被注释为：早期间充质祖细胞（EMPs）、中间间充质祖细胞（IMPs）、晚期间充质祖细胞（LMPs）、成骨细胞、骨细胞、谱系定型祖细胞（LCPs）、脂肪细胞以及两个软骨细胞群（来自生长板，后续分析中被排除）。 4. 细胞轨迹与分化路径推断：为了重建细胞的分化动态，研究使用Monocle和Slingshot两种算法进行了拟时序轨迹分析。分析结果显示，EMPs位于分化轨迹的起点，而骨细胞和脂肪细胞这两个终末分化细胞类型则位于轨迹的两个不同分支的末端，清晰地描绘出骨髓间充质祖细胞在体内分化为成骨和成脂谱系的“Y”字形分化路径。 5. 新细胞群（MALPs）的验证与功能研究：测序数据揭示了一个引人注目的现象：在年轻小鼠骨髓中存在一个庞大的细胞簇（第7簇），它高表达许多脂肪细胞标志基因（如Pparg, Cebpa, Adipoq），但却不表达脂滴包被蛋白基因Plin1，暗示其不含脂滴。研究团队随后构建了Adipoq-Cre; tdTomato报告小鼠来追踪和验证这群细胞。结果显示，这些td+细胞数量庞大，形态上表现为基质细胞或周细胞，不含脂滴，不增殖，体外不能形成CFU-F集落，体内移植不能成骨，表明它们不是间充质祖细胞。体外成脂诱导实验和体内谱系示踪实验（使用Adipoq-CreER小鼠）证实，这群无脂滴的td+细胞是位于间充质祖细胞和经典含脂滴脂肪细胞之间的、稳定的前体细胞阶段。 6. MALPs的形态与功能探究：通过厚组织切片三维成像，研究发现Adipoq标记的细胞（即MALPs）在骨髓腔内形成了一个广泛的三维网络结构。这些细胞伸出长长的突起，彼此连接，包裹血管，接触造血细胞和骨表面，提示其具有重要的通讯功能。它们高表达周细胞标志物（如Pdgfrb）和多种促血管生成因子（如Vegfa, Angpt4）。 7. 体内功能缺失实验：为了探究MALPs的功能，研究人员构建了Adipoq-Cre; tdTomato; DTR小鼠，通过注射白喉毒素（DT）特异性消融Adipoq标记的细胞。消融两周后，小鼠骨髓发生了显著变化：骨髓血管出现病理性扩张和扭曲，血管密度降低，内皮细胞减少；同时，在原本没有骨小梁的骨干区域出现了大量的新生骨，骨形成被异常激活。这些结果直接证明，MALPs对于维持正常的骨髓血管结构和抑制过度的骨形成至关重要。 8. 跨年龄分析与标记物重评估：研究还分析了3月龄和16月龄小鼠的数据，发现EMPs-LMPs-成骨/成脂的基本分化路径在不同年龄段保持一致。但随着衰老，EMPs数量减少且分子特征向成脂方向“漂移”，同时MALPs细胞簇（脂肪细胞簇）的数量大幅扩增，这与衰老时骨髓脂肪增多、骨形成减少的现象相符。研究还系统评估了以往文献中提出的多种“MSC标记物”（如Lepr, Gli1, Nestin等）在本研究定义的各个间充质亚群中的表达模式，澄清了这些标记物实际上更倾向于标记特定的分化阶段（如Lepr主要标记MALPs和衰老的EMPs）或非间充质细胞，而非真正的原始祖细胞。

主要结果： 1. 绘制了骨髓间充质谱系的体内分化图谱：单细胞测序结合拟时序分析，首次在分子层面清晰描绘了从早期祖细胞（EMPs）出发，经过中间状态（IMPs, LMPs），最终分岔为成骨谱系（LCPs -> 成骨细胞 -> 骨细胞）和成脂谱系（MALPs -> 含脂滴脂肪细胞）的完整体内路径。EMPs的特征是表达Sca1, CD34, Thy1等干细胞相关基因，但不表达成骨或成脂的主调控因子。 2. 发现并定义了一个全新的脂肪谱系细胞群——骨髓成脂谱系前体细胞（MALPs）：这是本研究的核心发现。MALPs表达成熟的脂肪细胞转录程序（包括Pparg, Cebpa, Adipoq），但不储存脂滴（Plin1-, Fabp4低），形态上为网状基质细胞或周细胞，数量远超含脂滴的经典脂肪细胞。它们是非增殖性的前体细胞，在成脂分化路径上处于一个稳定的过渡阶段。 3. 揭示了MALPs独特的形态与关键功能：三维成像显示MALPs通过细胞突起在骨髓内形成广泛的网络，与多种细胞成分接触。功能上，它们是骨髓微环境的关键调节者：① 维持血管稳态：消融MALPs导致骨髓血管严重畸形，提示其作为周细胞/基质细胞对血管结构起支持作用；② 抑制骨形成：消融MALPs后，骨髓中异位骨形成被强烈激活，表明它们正常情况下是骨形成的强力抑制因子。这两个功能可能通过其分泌的多种因子（如血管生成因子、趋化因子）来实现。 4. 阐明了衰老过程中间充质谱系的变化：比较转录组学分析显示，衰老伴随着EMPs池的缩小和成脂倾向的增强，以及MALPs群体的大幅扩增。这从细胞组成变化的角度为“衰老导致骨髓脂肪增多、骨形成减少”提供了机制性解释。 5. 重新评估了传统MSC标记物：研究明确指出，许多曾被用作“MSC”标记的基因（如Lepr, Cxcl12）实际上主要高表达于终末分化的MALPs或特定分化阶段的细胞，而非最原始的、具有双向分化潜能的EMPs。这澄清了领域内长期存在的概念混淆。

结论与价值：本研究通过前沿的单细胞技术，系统性地解析了骨髓间充质谱系的体内等级结构，并鉴定出一种全新的、功能独特的脂肪谱系细胞——骨髓成脂谱系前体细胞（MALPs）。研究结论认为，骨髓脂肪组织（MAT）不仅包括含脂滴的脂肪细胞，更应包含数量庞大、无脂滴的MALPs。MALPs并非简单的“前脂肪细胞”，而是一种骨髓特异性的、具有调节功能的细胞类型，它们通过形成三维网络和分泌因子，在维持骨髓血管完整性和抑制骨形成方面发挥核心作用。这项工作的科学价值在于：① 为理解骨髓微环境的细胞构成和相互作用提供了全新的蓝图；② 揭示了骨髓脂肪细胞谱系分化中存在一个以前未知的、功能活跃的中间阶段；③ 为骨质疏松等骨骼疾病的发病机制（如衰老相关的脂质增多和骨丢失）提供了新的细胞和分子层面的见解；④ 澄清了间充质祖细胞标记物的认识，推动了该领域的精准研究。其应用潜力在于，MALPs可能成为治疗骨质疏松、骨髓血管病变或调节骨髓微环境以适应造血需求的新靶点。

研究亮点： 1. 重要的原创性发现：首次在体内鉴定并功能验证了MALPs这一全新的骨髓脂肪谱系细胞亚群，从根本上扩展了我们对骨髓脂肪组织的认知。 2. 方法学的系统性与创新性：巧妙结合了遗传谱系示踪小鼠模型（Col2:td）、先进的大规模单细胞测序、计算生物学轨迹分析以及严谨的体内外功能验证实验，构成了一个完整且强有力的证据链。 3. 对经典问题的深入阐释：清晰描绘了间充质祖细胞体内分化的完整路径，解决了该领域长期悬而未决的基础问题；同时，通过跨年龄分析，将细胞层面的变化与衰老表型直接联系起来。 4. 概念的澄清与更新：对众多“MSC标记物”表达模式的重新评估，有助于纠正领域内可能存在的误读，促进更精确的细胞定义和研究。

其他有价值的内容：本研究还与同期发表的其他几项利用单细胞测序研究骨髓基质细胞的工作进行了数据比较（如Tikhonova et al., 2019; Baryawno et al., 2019），指出虽然细胞聚类模式和基因特征相似，但对细胞簇的注释存在差异，这进一步凸显了本研究中利用Col2:td模型全面标记所有间充质谱系细胞进行测序的优势，以及明确区分祖细胞阶段和终末分化阶段细胞（如MALPs）的重要性。文章最后还提出了有趣的开放性科学问题，例如为何骨髓间充质祖细胞需要启动脂肪细胞转录程序来成为骨髓环境的中心调节者，以及MALPs调控其周围环境的详细分子机制，这为未来研究指明了方向。