这是一份针对原创研究论文的学术报告。

作者与发表信息

该研究的主要作者为Yong Shen、Bohan Li、Lei Dong、Wei Tang、Jiwu Ren、Feng Chen、Wenjuan Zheng、Ying Yu、Lu Gao及Wensheng Wei。通讯作者为北京大学生命科学学院的Wensheng Wei。研究单位包括北京大学、昌平实验室以及Therorna Inc.。该研究于2025年发表在《Nature Communications》期刊上。

研究背景

该研究属于RNA治疗与分子生物学领域。环状RNA（circRNA）因其共价闭合环状结构带来的高稳定性和蛋白编码潜力，在RNA治疗领域备受关注。然而，现有的体外RNA环化技术，如广泛使用的基于排列内含子-外显子（permuted intron-exon, PIE）策略的I型内含子自剪接方法，仍面临诸多挑战。这些挑战包括：对内含子特定断裂位点的依赖导致通用性差；高效环化大尺寸RNA（特别是超过9000个核苷酸的RNA）的技术障碍；以及体外合成环状RNA中因杂质或外源“疤痕”序列（scar sequences）引发的免疫原性问题。为了解决这些局限性，该研究团队开发了两种新的RNA环化技术，旨在提高效率、扩大适用性，并实现对环状RNA产物纯度和免疫原性的更好控制。

详细工作流程与方法

研究主要分为以下几个步骤：

1. 新环化技术PIET和CIRC的设计与验证：

   • 研究对象：以I型内含子自剪接系统为核心，使用包含报告基因（如增强型绿色荧光蛋白，EGFP）的RNA前体。
   • 实验流程：研究团队首先基于I型内含子的两步酯交换反应机制，提出绕过第一步反应、仅利用第二步反应进行环化的假设。他们首先开发了PIET（permuted intron-exon through trans-splicing，通过反式剪接排列内含子-外显子）方法，该方法将剪接系统拆分为两个独立转录的RNA组分（中间体和5’-内含子），混合后通过反式剪接实现环化。通过调节5’-内含子与中间体的比例，他们测试了PIET的环化效率。
   • 技术创新：在PIET基础上，研究团队进一步推测完整、未断裂的内含子也能通过类似第二步剪接的机制实现环化。他们将此方法命名为CIRC（complete self-splicing intron for RNA circularization，完整自剪接内含子用于RNA环化）。为了验证，他们构建了包含完整I型内含子的前体，并在无GTP（三磷酸鸟苷，第一步剪接所必需的辅因子）条件下测试其环化能力，通过RT-PCR、RNase R处理和细胞转染表达EGFP来确认环状RNA的产生。

2. CIRC技术的序列优化：

   • 研究对象：包含不同长度外显子、同源臂（homology arm）和间隔序列（spacer）的RNA前体构建体。
   • 实验流程：为提升CIRC的性能，研究团队对其构建体进行了系统优化。他们测试了一系列变量对环化效率的影响，包括：5’和3’外显子长度（0-60个核苷酸）、同源臂长度（9-200个核苷酸）以及外源或内源间隔序列的长度和位置。环化效率通过在37°C和55°C下反应后的凝胶电泳定量，并通过流式细胞术评估不同构建体在HEK293T细胞中的蛋白表达水平，以平衡环化效率与翻译效率。

3. CIRC方法通用性的拓展与大尺寸RNA的环化：

   • 研究对象：来自不同物种的多种I型和II型内含子，以及编码长达12,206个核苷酸的全长人类抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的RNA序列。
   • 实验流程：为验证CIRC的通用性，研究人员依据优化的构建框架，将完整的天然I型或II型内含子与其匹配的外显子序列配对，测试其环化能力。对于超大尺寸RNA，他们引入了一种GTP类似物——环磷酸鸟苷（cGMP）来抑制转录过程中的内含子过早剪接，并优化了体外转录（IVT）缓冲液的镁离子浓度。随后，通过琼脂糖凝胶电泳、RT-qPCR和Western blot分别验证了不同长度RNA的完整性、环状RNA连接点的富集和全长蛋白的表达。

4. 无疤痕（Scarless）环状RNA的生成与免疫原性评估：

   • 研究对象：包含最小化外源序列的环状RNA构建体，以及A549细胞系。
   • 实验流程：为生成无疤痕环状RNA，研究人员系统性地缩短外显子序列，并利用I型内含子P1茎的碱基配对灵活性，通过编程外显子序列（“NNUAA”基序）使其与目标RNA内部序列匹配来消除疤痕。他们测试了在CVB3 IRES（内部核糖体进入位点）序列内的多个断裂位点。随后，将不同疤痕长度及T4 RNA连接酶生成的无疤痕环状RNA转染A549细胞，通过RT-qPCR检测RIG-I、IL-6和TNF-α等炎症相关基因的表达，来评估其免疫原性。

5. 简化环状RNA纯化流程的探索：

   • 研究对象：CIRC反应产物混合物。
   • 实验流程：为简化纯化，研究评估了两种策略。其一，利用CIRC快速环化、减少内含子连接成环的特性，在IVT反应早期（2-4小时）取样，直接用RNase R消化线性前体和游离内含子。其二，通过在I型内含子的P6结构域中插入poly(A)序列，使线性前体和内含子副产物带上poly(A)尾，从而能被oligo(dT)磁珠或商业oligo(dT)层析柱有效去除，实现一步法纯化。

主要研究结果

1. PIET与CIRC技术的有效性确认：实验证实，PIET作为一种双组分系统，能够通过反式剪接成功生成环状RNA。更重要的是，CIRC利用完整的内含子，无需GTP即可高效完成环化。凝胶电泳、RNase R抗性分析、poly(A)聚合酶处理和细胞转染后的蛋白表达均证实了功能性环状RNA的产生。去除PIE中必需的同源臂后，CIRC的环化效率反而显著提高。

2. 优化后的CIRC性能优越：序列优化实验揭示了关键参数：至少16个核苷酸的外显子和更长的同源臂能显著提升环化效率，但过长的同源臂（>75核苷酸）会损害翻译。最终优化的构建（各16个核苷酸外显子、19-50个核苷酸同源臂、30个核苷酸外间隔序列）实现了效率和翻译的平衡。在相同条件下与PIE比较，CIRC在多种RNA负载下均展现出更高的环化效率和最终纯化产率。尤为突出的是，CIRC在极低镁离子浓度（0.2 mM）、较低pH和更短时间内即可完成环化，在IVT反应中仅需1小时就达到PIE在16小时后的效率，这对保持RNA完整性至关重要。

3. CIRC突破了尺寸限制并具有广谱适用性：CIRC成功环化了编码全长人类抗肌萎缩蛋白的RNA（12,206个核苷酸），远超以往报道的约9,000核苷酸的极限，并在细胞中实现了427 kDa全长蛋白的表达，Western blot结果证实了这一点。此外，CIRC框架成功应用于多种I型和II型内含子，均能产生功能性环状RNA，证明了其高通用性。

4. CIRC可实现低免疫原性、无疤痕环状RNA生产：研究确定了用于无疤痕环化的最小外显子基序“NNUAA”，并成功利用RNA内部序列（如CVB3 IRES）替代疤痕序列进行高效环化。免疫原性测试表明，所有经磷酸酶处理的、由CIRC生成的环状RNA均表现出极低的免疫原性，与T4 RNA连接酶产生的无疤痕环状RNA相当，且未发现疤痕长度与免疫原性之间存在直接关联。

5. CIRC有利于简化纯化：由于CIRC线性前体的3’端结构更简单，其对RNase R消化的敏感性高于PIE前体。利用CIRC在IVT早期的快速环化特性，可有效避免内含子自连接，从而使RNase R消化更为高效。同时，内含子中poly(A)的插入（超过25个核苷酸）对剪接影响甚微，并能通过oligo(dT)方法在单轮或多轮纯化中彻底去除杂质，获得高纯度环状RNA。

研究结论与价值

该研究成功建立了PIET和CIRC这两种新型RNA环化技术。其中，CIRC技术利用完整自剪接内含子，绕过了传统PIE方法对内含子断裂位点的依赖，在环化效率、反应条件温和性、RNA完整性保持、大尺寸RNA环化能力以及产物纯化便捷性等方面均展现出显著优势。这些突破不仅为环状RNA的基础研究提供了更强大的工具，也为下一代RNA疗法（如针对杜氏肌营养不良等由大分子蛋白缺陷引起的疾病的蛋白替代疗法）的开发扫清了关键技术障碍，极大地拓展了环状RNA平台在研究和治疗中的应用潜力。

研究亮点

1. 机制创新：发现了不依赖第一步剪接和GTP，仅利用完整自剪接内含子进行RNA环化的新机制（CIRC）。
2. 性能突破：CIRC技术显著突破了现有技术对RNA环化的尺寸限制，首次成功高效环化编码全长抗肌萎缩蛋白的超大RNA并实现蛋白表达。
3. 应用价值高：CIRC在低镁、低pH和短时间等温和条件下高效环化，有利于保护RNA完整性；其生成的环状RNA免疫原性低，且能无缝兼容RNase R和oligo(dT)等简化的纯化流程，为高质量环状RNA药物的规模化生产提供了可行策略。