本文报道了一项关于多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）中增强子调控机制的原创性研究。该研究由南洋理工大学（Nanyang Technological University）生物科学学院的Daniel Aron Ang和Yinghui Li，以及卡迪夫大学（Cardiff University）生物科学学院的Nathan Harmston共同完成。研究成果发表于*Cancer Letters*期刊，该文于2025年1月29日收稿，2025年4月3日修订，2025年4月16日接收并在线发表。
研究背景
多发性骨髓瘤是一种起源于骨髓中浆细胞的B细胞恶性肿瘤，约占所有血液系统癌症的20%。该病的特征为异常浆细胞在骨髓中不受控制地增殖，导致单克隆免疫球蛋白（M蛋白）过度产生。既往研究表明，非经典NF-κB（non-canonical NF-κB, ncNF-κB）通路的组成性激活与MM患者的不良预后和高危分层存在因果关联。该通路中的转录因子p52能够重塑MM的增强子景观，从而促进致癌转录程序。然而，p52如何协调增强子活性的具体分子机制尚不清楚。已知p52可与其他转录因子形成异源二聚体，且p65等NF-κB家族成员能招募组蛋白乙酰转移酶p300/CBP至靶基因启动子。基于这些背景，本研究旨在鉴定与p52协同调控MM相关增强子的转录因子，并阐明其通过招募p300/CBP激活超级增强子进而驱动致癌基因表达的机制。
研究流程与实验方法
研究首先利用H3K27ac ChIP-seq和ATAC-seq数据，在携带TRAF3或NIK突变、具有高NF-κB活性的MM细胞系中筛选p52结合增强子区域富集的转录因子基序。通过HOMER基序分析，研究者将p52结合的H3K27ac区域分为启动子区和非启动子区，并在六种ncNF-κB激活的MM细胞系中鉴定出锌指（ZF）、同源异型盒（homeobox）、碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）、碱性亮氨酸拉链（bZIP）和ETS等转录因子家族的基序富集。随后，利用TOBIAS软件分析p52敲低后ATAC-seq峰的足迹动态，并结合MM患者中NF-κB高与低活性样本的染色质可及性差异，筛选出ATF4作为与p52协同调控增强子的候选转录因子。为验证ATF4与p52的共结合，研究者在KMS-11细胞中进行了ATF4 ChIP-seq，发现440个基因组区域同时包含p52和ATF4结合位点，其中222个位点同时被H3K27ac标记。
为明确ATF4和p52对增强子活性的调控作用，研究者在KMS-11和MM1.144细胞中分别进行了ATF4或p52的CRISPR敲低，随后通过H3K27ac ChIP-seq和ATAC-seq分析增强子活性和染色质可及性的变化。结果显示ATF4敲低导致超过95%（KMS-11）和52%（MM1.144）的H3K27ac标记丢失，且ATAC-seq信号在ATF4结合区域同步下降，H3K27ac丢失与染色质可及性降低呈显著正相关。进一步将ATF4和p52共同调控的增强子与p52敲低后下调的基因及超级增强子区域整合，鉴定出BCL2、CFLAR等MM依赖基因。为探究p300/CBP在其中的作用，研究者进行了p300和CBP的ChIP-seq，发现这两种组蛋白乙酰转移酶在ATF4和p52共同调控的增强子处显著富集。
针对BACH1基因，研究者鉴定了其近端超级增强子同时被ATF4、p52、CBP和p300结合。通过H3K27ac Hi-ChIP数据，发现p52敲低后BACH1超级增强子与启动子之间的三个染色质互作环丢失。利用CRISPR技术在KMS-11细胞中删除该超级增强子内626 bp的ATF4/p52共结合区域，结果导致BACH1表达完全丧失。ChIP-qPCR实验显示，敲低ATF4会降低p52在BACH1超级增强子处的富集，反之亦然，表明两者的结合相互依赖。荧光素酶报告基因实验表明，单独过表达p52即可激活BACH1超级增强子，而同时过表达ATF4和p52可使活性提高3倍以上。通过构建ATF4的bZIP结构域缺失突变体和p52的RHD亚结构域或GRR缺失突变体，发现ATF4的bZIP结构域以及p52的RHD和GRR结构域均为增强子激活所必需。用p300/CBP催化抑制剂A-485或溴结构域抑制剂SGC-CBP30处理细胞后，CFLAR和BACH1的表达及超级增强子处的H3K27ac水平均显著下降。在293T细胞中过表达ATF4和p52后再用上述抑制剂处理，发现p52单独激活BACH1超级增强子的能力不受影响，而ATF4与p52共同过表达时的增强子激活作用被显著抑制，说明p300/CBP的功能主要通过ATF4介导。ATF4的N端结构域部分缺失突变体同样丧失激活能力，进一步支持ATF4负责招募p300/CBP的结论。
为探究BACH1在MM中的功能，研究者在KMS-11细胞中进行了BACH1 ChIP-seq，发现85%的结合峰位于非启动子区域。BACH1敲低导致全基因组超过99%的差异H3K27ac峰为增加，相关基因富集于细胞周期进程、p53信号通路和细胞死亡等致癌通路。细胞周期分析显示BACH1敲低导致细胞阻滞于G0/G1期，细胞增殖能力显著下降。使用双gRNA CRISPR系统敲除BACH1同样显著抑制了MM细胞的体外增殖能力。在Rag−/−IL2Rγ−/−小鼠中进行的肿瘤异种移植实验表明，BACH1敲低的肿瘤生长显著减缓，小鼠生存期明显延长。机制上，BACH1敲低导致p21蛋白水平升高，CDKN1A（编码p21）基因座位的超级增强子H3K27ac水平上升，表明BACH1通过抑制p21表达促进细胞周期进程和增殖。
主要结果与结论
本研究证明ATF4与p52在MM细胞中形成蛋白复合物，共同结合于致癌增强子和超级增强子区域。该复合物通过ATF4的N端结构域招募组蛋白乙酰转移酶p300和CBP，后者催化H3K27乙酰化，从而激活增强子及其靶基因的转录。在NF-κB高活性的MM肿瘤中，p52和ATF4高表达，共同激活BACH1超级增强子，驱动BACH1高表达。BACH1作为转录抑制因子，通过结合CDKN1A的超级增强子抑制p21表达，进而促进细胞周期进程和肿瘤增殖。相反，在NF-κB低活性的MM中，p52和ATF4表达较低，BACH1水平下降，p21启动子区域可被p300/CBP占据并激活，p21表达升高，抑制CDK活性，导致细胞周期阻滞和肿瘤生长减缓。该研究首次揭示了p52-ATF4-BACH1调控轴在MM中的存在及其分子机制，阐明了异常增强子激活如何导致疾病进展，为携带NF-κB激活突变的MM患者疾病严重程度增加提供了机制解释。
研究亮点与价值
本研究的亮点在于：第一，发现了ATF4作为p52的协同转录因子，在MM中共同调控增强子活性；第二，明确了ATF4:p52复合物通过ATF4的N端结构域招募p300/CBP的分子机制，而并非通过p52本身；第三，鉴定了BACH1作为该复合物调控的新靶基因，并证明其通过抑制p21促进MM细胞周期进程和增殖；第四，利用CRISPR介导的超级增强子删除和荧光素酶报告系统等功能实验验证了ATF4:p52共结合对BACH1超级增强子激活的必要性。该研究不仅为MM的增强子调控机制提供了新的见解，也为以p300/CBP或BACH1为靶点的治疗策略提供了理论依据。