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骨细胞线粒体调控跨皮质血管新生：一项关于骨内血管稳态维持新机制的研究

一、 主要作者、研究机构及发表信息

本项研究由以彭廖、陈龙、周浩（共同第一作者）和张长清、刘德林、郑明浩、高俊杰（通讯作者）为首的国际合作团队完成。参与机构包括上海交通大学医学院附属第六人民医院骨科、上海市四肢显微外科研究所、中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞生物学国家重点实验室、浙江大学医学院附属第二医院骨科、西澳大利亚大学医学与健康科学学院骨科研究中心、Perron神经与转化科学研究所、山西医科大学口腔医学院等。该研究成果以《Osteocyte mitochondria regulate angiogenesis of transcortical vessels》为题，于2024年发表在 Nature Communications 期刊上。

二、 学术背景与研究目的

本研究的主要科学领域是骨生物学与血管生物学的交叉领域，聚焦于皮质骨微环境内细胞间通讯与稳态调控。

骨骼内拥有丰富的血管网络，对骨骼发育、稳态维持、损伤修复及骨髓功能至关重要。其中，跨皮质血管（Transcortical Vessels， TCVs） 是一类独特的血管结构，它们垂直穿过坚硬的皮质骨，连接骨髓腔内的血管系统与骨外膜循环，是骨髓与外界进行物质交换（如超过80%的动脉血、59%的静脉血及多种免疫细胞）和细胞通讯的关键通道。尽管其功能重要，但调控TCV形成和稳态维持的细胞与分子机制尚不明确。

在皮质骨中，骨细胞（Osteocytes） 占所有骨细胞的90%-95%，它们深嵌于矿化的骨基质中，并延伸出大量树突相互连接形成网络。骨细胞作为骨骼的主要机械感受器和内分泌细胞，在调节骨重塑中发挥核心作用。形态学证据显示骨细胞树突与TCV的内皮细胞存在密切接触，这暗示骨细胞可能参与调控TCV的血管化过程，但直接的因果证据和调控机制尚未被揭示。

基于此背景，本研究旨在探究以下核心问题：1）骨细胞是否以及如何调控TCV的血管网络稳态？2）骨细胞与TCV内皮细胞之间是否存在直接的物质（特别是细胞器）交流？3）这种交流对TCV的功能和骨修复有何影响？研究的目标是阐明骨细胞-TCV相互作用的新机制，并为骨相关疾病的治疗提供新的思路。

三、 详细研究流程与方法

研究采用了多层次、多技术整合的策略，从形态学关联确认到功能学机制探索，再到体内外功能验证与治疗潜力评估，流程严谨而系统。

流程一：确认骨细胞与TCV内皮细胞的形态学联系 研究首先利用多种高分辨率成像技术，在多个尺度上证实了骨细胞与TCV内皮细胞的物理连接。 1. 研究对象：2-4月龄野生型（WT）雄性C57BL/6J小鼠的股骨皮质骨。 2. 研究方法与实验： * 扫描电子显微镜（SEM）与透射电子显微镜（TEM）：对小鼠股骨皮质骨样本进行处理和成像。SEM图像清晰显示骨细胞延伸出树突，其末端呈膨大的“终足”样结构，直接接触TCV管壁。TEM图像进一步在亚细胞水平证实了骨细胞树突与血管管内皮细胞之间的连接。 * 活体染料示踪与免疫荧光染色：向小鼠腹腔注射伊文思蓝（Evans Blue）染料，使其在血液循环中标记血管。同时，采用免疫荧光技术标记内皮细胞标志物CD31和细胞骨架蛋白（鬼笔环肽标记肌动蛋白以显示骨细胞形态）。通过共聚焦显微镜对股骨冠状切片进行三维成像。 3. 数据分析：对共聚焦图像进行定量分析，统计靠近TCV的骨细胞树突分布。结果显示，约60.27%的骨细胞树突分布在靠近血管的一侧，其中高达74.20%的树突与内皮细胞直接接触。此外，靠近TCV的骨细胞体长轴方向会发生明显偏转以对齐血管，而非骨长轴。这些数据共同证实了骨细胞与TCV内皮细胞之间存在着广泛且特异性的树突接触。

流程二：探究骨细胞缺失对TCV网络的影响 为了建立骨细胞与TCV功能之间的因果关系，研究构建了特异性靶向骨细胞的基因工程小鼠模型。 1. 研究对象：构建了Dmp1Cre-DTAki/wt 小鼠。Dmp1是骨细胞高表达的基因，利用Dmp1启动子驱动Cre重组酶，可特异性在骨细胞中表达白喉毒素A亚基（DTA），从而实现部分消融骨细胞。以DTAki/wt小鼠作为对照。 2. 研究方法与实验： * 高分辨率显微计算机断层扫描（μCT）：对6周龄小鼠股骨进行1微米高分辨率扫描，三维重建垂直于骨长轴的皮质骨管腔网络，以此作为TCV形态的替代指标进行分析。 * 免疫荧光染色：对股骨切片进行CD31免疫荧光染色，直观观察TCV网络的二维形态。 * 批量RNA测序（RNA-seq）与生物信息学分析：提取4周龄对照和突变小鼠股骨皮质骨的总RNA进行测序。通过基因本体论（GO）分析和基因集富集分析（GSEA），寻找差异表达的生物学通路。 * qPCR验证：对RNA-seq中发现的差异表达基因进行定量验证。 * 体外共培养功能实验：使用小鼠骨细胞样细胞系MLO-Y4和小鼠内皮细胞系BEND.3。通过siRNA敲低MLO-Y4中RNA-seq筛选出的血管生成相关基因（VEGFC， SLIT3， NOTCH3， NOTCH4），收集条件培养基，用于BEND.3细胞的体外成管实验和划痕愈合实验，检验这些因子是否介导骨细胞对内皮细胞的直接调控。 3. 数据分析：μCT和免疫荧光结果均显示，骨细胞部分消融后，TCV网络变得粗糙、不连续、分支减少，血管网络复杂度显著下降。RNA-seq分析显示，突变小鼠皮质骨中“血管生成”是下调最显著的生物学过程之一，并鉴定出VEGFC、SLIT3等血管生成相关基因下调。然而，体外实验表明，单独敲低这些基因并未显著影响MLO-Y4条件培养基对内皮细胞成管和迁移的促进作用，暗示存在其他更直接的调控机制。

流程三：发现并验证骨细胞向TCV内皮细胞的线粒体转移 基于骨细胞网络已知的线粒体传递能力以及线粒体在血管生成中的关键作用，研究提出了新的假说：骨细胞通过转移线粒体来维持TCV稳态。 1. 研究对象： * 体外：MLO-Y4细胞（线粒体用Dendra2绿色荧光蛋白标记）与BEND.3内皮细胞共培养体系。 * 体内：构建了Dmp1Cre-Cox8Dendra2 小鼠，该品系可在骨细胞中线粒体特异性表达Dendra2荧光蛋白。同时构建了Dmp1Cre-MGMT 小鼠，用于确认Dmp1表达细胞（骨细胞）与内皮细胞是相邻但不同的细胞群体。 2. 研究方法与实验： * 体外共培养与成像：将线粒体标记的MLO-Y4细胞与细胞膜染料标记的BEND.3细胞按不同比例共培养不同时间，通过共聚焦显微镜和流式细胞术检测内皮细胞内出现Dendra2荧光信号的比例，定量线粒体转移效率。 * 体内成像验证：对Dmp1Cre-Cox8Dendra2小鼠股骨进行CD31/Dendra2/DAPI共染色，通过共聚焦显微镜直接观察骨细胞来源的线粒体（绿色）是否出现在TCV内皮细胞（红色）内。通过正交视图（Orthogonal View）进行三维确认。 3. 数据分析：体外实验证实，MLO-Y4细胞能将线粒体转移给BEND.3内皮细胞，转移效率随共培养时间和供体/受体细胞比例增加而提高。体内实验提供了决定性证据：在Dmp1Cre-Cox8Dendra2小鼠的皮质骨中，约79.95%的TCV片段内能检测到来自骨细胞的Dendra2标记的线粒体，且这些信号与CD31标记的内皮细胞共定位。对照实验排除了Dmp1在内皮细胞中非特异性表达的可能性。这首次在体证明了骨细胞向TCV内皮细胞进行线粒体转移。

流程四：验证线粒体转移对TCV血管化的功能性调控及其关键蛋白 接下来，研究需要证明这种线粒体转移是功能必需的，并探索其分子机制。 1. 研究对象： * 基因干扰模型：在MLO-Y4细胞中敲低线粒体运动关键蛋白Miro1的编码基因Rhot1，构建Rhot1KD细胞系。 * 基因敲除小鼠模型：构建了Dmp1Cre-Cox8Dendra2-Rhot1fl/fl 小鼠（在骨细胞中同时标记线粒体并敲除Rhot1）和Dmp1Cre-Rhot1fl/fl 小鼠（仅在骨细胞中敲除Rhot1）。 2. 研究方法与实验： * 体外功能抑制：将Rhot1KD的MLO-Y4细胞与BEND.3细胞共培养，通过流式细胞术检测线粒体转移效率是否降低。 * 体内表型分析：对Dmp1Cre-Rhot1fl/fl小鼠及其对照进行μCT扫描和CD31免疫荧光染色，分析TCV网络形态。对Dmp1Cre-Cox8Dendra2-Rhot1fl/fl小鼠进行成像，定量比较TCV内皮细胞内获得的线粒体数量。 * 排除间接影响：通过组织学染色（ALP， TRAP）、流式细胞术分析骨髓细胞、TUNEL凋亡检测、SEM分析骨细胞陷窝形态、以及骨微结构μCT分析等一系列实验，系统评估Rhot1敲除是否影响了成骨细胞、破骨细胞、骨细胞活力/形态或骨量本身，以确认TCV表型是线粒体转移受阻的直接结果，而非其他骨细胞功能改变引起的间接效应。 3. 数据分析：体外和体内实验一致表明，抑制Rhot1显著降低了骨细胞向内皮细胞的线粒体转移效率。Dmp1Cre-Rhot1fl/fl小鼠的TCV网络出现了与骨细胞消融小鼠类似的退化表型：血管分支减少，管腔网络粗糙、不连续。排除性实验证实，Rhot1敲除并未显著改变其他骨细胞类型、骨细胞活力/形态或整体骨量，从而强有力地证明了Miro1介导的线粒体转移是维持TCV血管网络稳态所必需的直接机制。

流程五：阐明获得性骨细胞线粒体对内皮细胞功能的修复作用 研究进一步探究骨细胞线粒体如何从细胞功能层面“拯救”内皮细胞。 1. 研究对象：BEND.3内皮细胞，使用线粒体复合体III和I抑制剂抗霉素A（Antimycin A）和鱼藤酮（Rotenone， A/R）诱导其线粒体功能障碍和氧化应激。 2. 研究方法与实验： * 线粒体移植（Mitochondrial Transplantation）：从MLO-Y4细胞中分离出完整的线粒体，直接与健康或A/R损伤的BEND.3细胞共孵育。 * 细胞功能学检测： * 氧化磷酸化（OXPHOS）能力：使用Seahorse细胞能量代谢分析仪测量细胞耗氧率（OCR）。 * 活性氧（ROS）水平：使用DCFH-DA荧光探针通过流式细胞术检测。 * 细胞增殖：CCK-8试剂盒检测。 * 血管生成能力：基质胶体外成管实验。 * 细胞迁移能力：细胞划痕愈合实验。 3. 数据分析：获得骨细胞线粒体后，A/R损伤的内皮细胞表现出：1）OXPHOS能力（基础呼吸、ATP产量、最大呼吸能力）显著恢复；2）ROS水平显著降低；3）增殖、成管和迁移能力得到有效修复。这些结果证明，骨细胞来源的线粒体能够改善内皮细胞的能量代谢、缓解氧化应激，从而全面恢复其血管生成功能。

流程六：探索线粒体转移促血管生成的潜在代谢物机制 研究试图从代谢物角度揭示线粒体转移下游的效应分子。 1. 研究对象：接受或未接受骨细胞线粒体移植的BEND.3细胞。 2. 研究方法与实验： * 非靶向代谢组学分析：比较两组细胞的代谢物谱差异。 * 靶向验证与功能模拟：筛选出差异代谢物D-鞘氨醇（D-sphingosine）。在体外实验中，直接向A/R损伤的BEND.3细胞补充外源D-鞘氨醇，观察其能否模拟线粒体移植的“拯救”效果（检测ROS、增殖、成管、迁移）。 * 信号通路探究：D-鞘氨醇可被鞘氨醇激酶1（SphK1）磷酸化为具有强促血管生成活性的鞘氨醇-1-磷酸（S1P）。研究通过ELISA检测线粒体移植后内皮细胞内S1P水平的变化。并使用SphK1特异性抑制剂PF-543预处理MLO-Y4细胞，再提取其线粒体进行移植实验，观察对内皮细胞功能的挽救作用是否被阻断。 3. 数据分析：代谢组学发现，获得骨细胞线粒体的内皮细胞中D-鞘氨醇水平显著上调。体外功能实验证实，补充低剂量D-鞘氨醇能够有效模拟骨细胞线粒体的作用，恢复损伤内皮细胞的功能。机制上，骨细胞线粒体移植提升了内皮细胞内S1P水平；当使用PF-543抑制骨细胞（线粒体供体）的SphK1活性后，其线粒体对受损内皮细胞的修复能力被显著削弱。这表明骨细胞线粒体至少部分通过激活内皮细胞内的鞘氨醇-S1P通路来发挥促血管生成作用。

流程七：评估骨细胞线粒体及D-鞘氨醇在骨修复中的治疗潜力 最后，研究在疾病模型中验证其发现的应用价值。 1. 研究对象：野生型小鼠，在其股骨远端皮质骨制造标准化骨缺损模型。 2. 研究方法与实验： * 治疗干预：分为两组，实验组在缺损局部注射从MLO-Y4细胞分离的线粒体，或通过口服灌胃给予D-鞘氨醇；对照组给予载体。 * 疗效评估： * 血管生成评估：术后特定时间点取骨痂组织，进行CD31免疫荧光染色，分析新生TCV网络的复杂度和分支数量。 * 骨愈合评估：通过μCT扫描，三维量化新骨生成量（骨体积分数BV/TV）、骨密度（BMD）等参数。 3. 数据分析：与对照组相比，接受骨细胞线粒体或D-鞘氨醇治疗的小鼠，其骨缺损区域表现出更快速、更丰富的TCV新生血管网络。相应地，μCT分析显示治疗组的新骨生成量和骨愈合质量也显著优于对照组。这证明了靶向骨细胞-内皮细胞线粒体转移轴或补充其下游代谢物，具有促进骨内血管生成和加速骨修复的治疗潜力。

四、 主要研究结果及其逻辑关系

本研究的结果环环相扣，逻辑严密： 1. 形态学基础：首先确认了骨细胞通过树突终足与TCV内皮细胞存在广泛而紧密的物理连接，为后续的物质交流提供了结构基础。 2. 功能学相关性：发现骨细胞缺失会导致TCV网络严重退化，并伴随血管生成相关基因表达下调，确立了骨细胞是TCV稳态维持的必要因素。 3. 机制发现：创新性地在体和离体证明了骨细胞能向TCV内皮细胞转移线粒体，且这一过程依赖于线粒体运动蛋白Miro1（由Rhot1基因编码）。特异性阻断Rhot1后，即使骨细胞本身存活且形态正常，TCV网络仍发生退化，直接证明了线粒体转移是关键机制，而非骨细胞的其他功能。 4. 功能解析：获得骨细胞线粒体，能有效修复因线粒体功能障碍而受损的内皮细胞，具体表现为恢复其能量代谢、降低氧化应激、并挽救其增殖、成管和迁移能力，从细胞功能层面阐明了线粒体转移如何维持血管生成能力。 5. 分子机制探索：代谢组学将作用机制指向鞘氨醇代谢通路。D-鞘氨醇能模拟线粒体的促血管生成作用，而抑制供体骨细胞的SphK1则会削弱其线粒体的修复效力，提示骨细胞线粒体可能通过提供或激活SphK1，促进内皮细胞内S1P的生成，从而驱动血管生成。 6. 转化应用验证：最终，在皮质骨缺损模型中，直接补充骨细胞线粒体或其下游效应分子D-鞘氨醇，均能有效促进缺损区的血管新生和骨愈合，将基础研究发现推向潜在的治疗应用。

这些结果层层递进，从现象到本质，从机制到应用，完整地描绘了“骨细胞通过Miro1依赖的线粒体转移，维持TCV内皮细胞功能及血管网络稳态，该过程涉及鞘氨醇代谢通路，并具有治疗骨缺损潜力”这一全新生物学轴心。

五、 研究结论与价值

本研究得出了一个核心结论：骨细胞是皮质骨内TCV血管网络稳态的关键调控者，其通过向TCV内皮细胞转移功能性线粒体来实现这一调控。这一过程依赖于Miro1蛋白，并能缓解内皮细胞的氧化应激、恢复其血管生成功能，其中涉及对鞘氨醇代谢通路的激活。

该研究的科学价值在于： 1. 发现了骨内微环境细胞间通讯的新模式：首次揭示了骨细胞与血管内皮细胞之间存在着活跃的细胞器（线粒体）转移，拓宽了对骨细胞作为“调控枢纽”细胞功能的认识。 2. **阐