Christian S. Diercks等人于2025年在《Science》期刊发表了题为《An orthogonal T7 replisome for continuous hypermutation and accelerated evolution in E. coli》的研究论文，该研究开发了一种基于T7噬菌体复制系统的正交DNA复制机制，可在大肠杆菌中实现持续高频突变和加速进化。以下为详细学术报告：
一、作者及机构
通讯作者为Scripps研究所的Christian S. Diercks和Peter G. Schultz，合作单位未明确列出但应属Scripps研究所团队。研究发表于《Science》第389卷（2025年），DOI: 10.1126/science.adp9583。
二、学术背景
研究领域：合成生物学与定向进化。
科学问题：传统定向进化技术依赖宿主固有复制系统，突变率受限且可能干扰宿主基因组稳定性。
背景知识：
1. T7噬菌体复制系统（replisome）由gp1（RNA聚合酶）、gp2.5（单链DNA结合蛋白）、gp4（解旋酶-引物酶）、gp5（DNA聚合酶）和gp3.5（溶菌酶）组成，可独立于宿主复制。
2. 已有研究表明，T7 DNA聚合酶（gp5）的突变体（如Δ28外切酶缺陷型）可提高错误率，但系统性优化正交复制系统的研究尚未开展。
研究目标：构建正交T7复制系统，实现可控高频突变，加速蛋白质进化。
三、实验流程
1. 系统构建与优化
- 质粒组装：通过Gibson Assembly将T7复制元件（gp1-gp5）克隆至不同质粒（表S1），使用Keio集合大肠杆菌BW25113为宿主。
- 突变体设计：针对gp5进行多位点饱和突变（NNK文库），包括外切酶结构域（Δ28）及催化核心区（如N520M、P560V等）。
- 正交性验证：通过qPCR测定T7复制子（φori）的拷贝数（表S3），确认其独立于宿主染色体复制。
2. 突变率测定
- 波动分析（fluctuation analysis）：
- 使用por-3质粒（含ochre终止密码子的TEM-1 β-内酰胺酶基因）作为报告基因。
- 通过卡那霉素抗性回复突变率计算突变频率（表S3），采用FALCOR工具进行Luria-Delbrück分析。
- 结果：五突变体（Δ28/N520M/P560V/V443K/Y24F/Q585R）的突变率达1.7×10⁻⁵ substitutions per base (spb)，比野生型高6000倍。
3. 功能验证
- β-内酰胺酶进化实验：
- 在T7rep-7菌株中引入por-4质粒（完整TEM-1基因），通过阶梯式增加头孢噻肟（cefotaxime）浓度（0.1→100 μg/mL）进行连续传代。
- 测序分析：发现启动子区（Pampr）和编码区（如E104K、R164S）的适应性突变（图S14-S16）。
- 基因组整合：利用POSIP系统将T7复制元件整合至大肠杆菌基因组（菌株T7rep-8），突变率保持稳定（1.7×10⁻⁵ spb）。
4. 数据分析
- 突变谱分析：
- 通过Illumina测序（1.2 billion reads）结合UMI（唯一分子标识符）校正PCR误差，绘制150 bp区域的突变热图（图3d）。
- 发现突变偏好性：如A/T→G/C转换占主导。
四、主要结果
- 突变率提升：五突变体gp5使T7复制子的突变率提升至1.7×10⁻⁵ spb（野生型为2.8×10⁻⁹ spb），且基因组突变率未显著增加（3.9×10⁻¹⁰ spb）。
- 正交性验证：T7复制子拷贝数稳定（4.1±0.5 copies/cell），宿主生长速率未受影响（倍增时间≈29.4分钟，表S5）。
- 应用案例：在14天内获得对头孢他啶（ceftazidime）耐药性提升500倍的TEM-1变体（MIC从0.4增至500 μg/mL）。
五、结论与意义
科学价值：
1. 首次实现正交复制系统的高频突变与宿主基因组的解耦，为定向进化提供新工具。
2. 揭示T7 DNA聚合酶关键残基（如Y24、Q585）对保真度的调控机制。
应用价值：
1. 加速蛋白质工程：可应用于抗体、酶等分子的快速进化。
2. 安全性：突变局限于T7复制子，避免宿主基因组不稳定。
六、研究亮点
- 方法创新：
- 开发可调控突变率的正交复制系统，突破宿主固有复制限制。
- 结合UMI的高通量突变谱分析技术，精准校正测序误差。
- 发现创新：
- 鉴定gp5五突变体组合，实现迄今大肠杆菌系统最高突变率。
- 揭示启动子突变（Pampr）在抗生素耐药性进化中的关键作用。
七、其他价值
- 提供完整的实验方案（如电转化效率测定、文库构建流程），支持技术重复。
- 公开质粒和菌株信息（表S1-S2），促进后续研究。
该研究为合成生物学和定向进化领域提供了突破性工具，未来或可扩展至真核系统。