新型交联氨基硅胶固定相的开发与色谱性能探索：一项针对经典氨基相稳定性问题的研究

一、 研究团队与发表信息

本研究由来自德国蒂宾根大学（University of Tübingen）药学院药物（生物）分析研究所的Michael Lämmerhofer教授团队主导，主要作者包括Marc Wolter、Christian Geibel、Matthias Olfert、Min Su等。合作者还包括奥地利维也纳大学（University of Vienna）分析化学研究所的Wolfgang Lindner教授团队等。该研究成果以题为“Development and chromatographic exploration of stable-bonded cross-linked amino silica against classical amino phases”的研究论文（Research Article）形式，于2022年9月发表在期刊《Journal of Separation Science》（JSS）的第45卷第17期上。

二、 学术背景与研究目的

本研究隶属于分析化学领域，具体聚焦于高效液相色谱（HPLC）固定相的开发与表征。氨基功能化硅胶是色谱分析中一种常用的固定相，尤其在亲水相互作用色谱（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC）和弱阴离子交换色谱（Weak Anion Exchange Chromatography, WAXC）模式下，广泛用于分离极性分析物，如糖类、核苷、磺胺类药物等。

然而，传统的氨基相（通常通过3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）与硅胶表面的硅醇基反应制得）存在一个显著的缺陷：水解稳定性差。在含水流动相条件下，氨基对硅氧烷键（Si-O-Si）具有自催化水解作用，导致键合的氨基配体逐渐从硅胶载体上脱落。这一过程会造成色谱柱寿命缩短、方法稳健性降低，以及在质谱检测中产生不利的背景噪声，严重限制了此类固定相在需要长期稳定性和高灵敏度检测的分析应用中的价值。

针对这一问题，学术界曾尝试多种改进策略，例如使用聚合物涂层（如聚乙烯亚胺，PEI）或通过环氧基团将聚合物交联并锚定在硅胶表面。这些方法虽在一定程度上提高了稳定性，但往往伴随柱效降低或引入非预期的疏水相互作用等问题。

因此，本研究旨在开发一种兼具优异水解稳定性和经典氨基相色谱性能的新型固定相。具体目标包括：1）利用硅杂环戊烷（Silatrane）化学实现氨基丙基配体在硅胶表面的高比例三官能键合，以提高基础稳定性；2）在此基础上，通过交联剂（三缩水甘油基异氰脲酸酯，Triglycidyl Isocyanurate）对表面的氨基丙基进行交联，形成稳定的三维网络结构；3）系统评估新固定相的水解稳定性、色谱性能（在反相色谱（RPC）、HILIC和WAXC模式下），并通过实际应用（如糖类和磺胺类药物的分离）展示其潜力。

三、 详细研究流程

本研究流程严谨，涵盖了材料合成、表征、稳定性测试、色谱性能评估和应用验证等多个环节。

1. 材料合成与制备： 研究首先制备了多种氨基功能化硅胶材料，以进行对比。 * 经典APTES硅胶（APTES-SP）：作为对照，使用APTES在甲苯中通过标准硅烷化反应制备。 * 硅杂环戊烷基氨基硅胶（APS-SP1-8）：这是本研究的关键前期工作。使用(3-氨丙基)硅杂环戊烷代替APTES，在催化剂4-二甲基氨基吡啶（DMAP）存在下与硅胶反应。反应后，配体硅原子上仍连接有三乙醇胺残基。随后，通过甲醇/水/甲酸混合液回流处理，水解去除该残基。此“硅烷化-水解”过程重复进行了四次，每次循环后取样（APS-SP1, SP3, SP5, SP7为硅烷化后样品；APS-SP2, SP4, SP6, SP8为水解后样品），以研究键合过程。最终产物APS-SP8用于后续交联。 * 新型交联氨基硅胶（Cross-linked amino phase）：将APS-SP8悬浮于四氢呋喃（THF）中，加入交联剂三缩水甘油基异氰脲酸酯。蒸发溶剂使交联剂均匀分布于硅胶表面薄膜中，随后在100°C下加热6小时，使氨基与环氧基发生亲核开环反应，形成环状酰胺-氨基丙基网络结构。 * 聚乙烯亚胺（PEI）基对比相：为了与聚合物稳定策略对比，合成了三种PEI改性硅胶：a) 涂覆PEI相（Coated PEI phase）：通过氢键和静电作用将PEI物理吸附在硅胶上；b) 固定化PEI相（Immobilized PEI phase）：先用(3-缩水甘油氧丙基)三甲氧基硅烷修饰硅胶引入环氧基，再通过氨基-环氧反应共价锚定PEI；c) 交联PEI相（Cross-linked PEI phase）：在固定化PEI相的基础上，再用1,4-丁二醇二缩水甘油醚进行交联。

此外，研究还选用了两根商品化氨基柱作为基准：一根经典刷型氨基柱（Classical APS），一根聚合物氨基柱（Polymeric APS， Phenomenex Luna NH2）。

2. 材料表征： 对所有合成材料进行了系统的物理化学表征。 * 元素分析：测定碳、氢、氮含量，计算表面氨基覆盖率（μmol/m²）。结果显示，交联后氮含量从APS-SP8的3.35 μmol/m²显著增加至7.45 μmol/m²，证实了交联剂的成功引入。 * 固态核磁共振（Solid-state NMR）：这是阐明表面化学和键合状态的关键技术。 * 13C CP/MAS NMR：用于确认有机配体的存在。对于APS-SP1/3/5/7，谱图中观察到三乙醇胺残基的特征峰，而在水解后的样品（APS-SP2/4/6/8）中该峰消失，证明了水解步骤的有效性。对于交联氨基相，出现了明显的酰胺羰基碳信号（~165 ppm），证实了交联结构的形成。 * 29Si CP/MAS NMR：用于分析硅胶表面硅原子的化学环境（Q2, Q3, Q4峰）以及键合有机硅烷的硅原子环境（T1, T2, T3峰）。T1、T2、T3分别代表单、双、三官能团键合的硅氧烷。分析表明，与APTES-SP相比，使用硅杂环戊烷制备的APS-SP8具有显著更高的T3峰比例（从33%提升至70%），表明三官能键合比例大幅增加，这有利于提高基础键合稳定性。

3. 水解稳定性测试： 这是评估固定相耐用性的核心实验。将所有制备的固定相及商品对照相填装成色谱柱，在严苛条件下进行加速老化测试：使用高含水流动相（乙腈/水/乙酸，30/70/0.1，v/v/v，pH 5）在60°C下连续冲洗50小时。在特定时间点（0, 7, 20, 50小时），切换至测试条件，分析两种酸性测试分析物（N-叔丁氧羰基-脯氨酰-苯丙氨酸 BocPropPhe 和 O,O-二乙基硫代磷酸酯 DETP）的保留时间，通过保留因子的变化来量化固定相流失情况。测试结束后，将填料从柱中取出，再次进行元素分析，直接测定氮含量的损失。

4. 色谱性能系统评估： 在多种色谱模式下对新开发的交联氨基相进行性能表征，并与前体APS-SP8及其他相进行对比。 * 反相色谱（RPC）模式：使用烷基苯（丁基苯和戊基苯）及酸性化合物混合物测试。结果显示，新相与经典氨基相一样，对烷基苯几乎没有保留，表明其表面亲水性占主导，疏水性残留可忽略不计。 * 亲水相互作用色谱（HILIC）模式：使用三组分析物进行测试：核苷（腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷、尿苷）、黄嘌呤类（咖啡因、茶碱、可可碱）和水溶性维生素。评估保留行为、选择性和柱效。新相表现出典型的HILIC保留特性，且对核苷的分离选择性有所改善（解决了APS-SP8上腺苷与尿苷共流出的问题）。 * 弱阴离子交换色谱（WAXC）模式：使用一系列氨基酸衍生物（酸性、碱性、两性离子和中性）作为探针，系统研究流动相pH（3.5, 5, 7）和离子强度（10, 20, 50 mM）对保留的影响。通过保留因子与缓冲液浓度的对数作图（计量置换模型），验证了其阴离子交换容量。结果表明，新相在pH 5附近对酸性分析物具有最大保留，符合弱阴离子交换剂的典型特征。

5. 主成分分析（PCA）分类： 为了在更广阔的色谱固定相空间中定位新相，研究选取了多种商品化色谱柱（包括HILIC相、极性反相相、混合模式相和氨基相）进行标准测试。将获得的保留因子数据进行主成分分析（PCA）。得分图显示，新开发的交联氨基相与经典氨基相在色谱空间中的位置相近，表明其保留了经典氨基相的基本保留特性，同时与酰胺型、磺酸甜菜碱型等常见HILIC相具有明显的正交性。

6. 潜在应用展示： * 糖类分离：在等度HILIC条件下，成功分离了木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖。值得注意的是，对于还原糖（如葡萄糖），新相未观察到异构体峰的分裂，简化了色谱图，有利于分析。 * 磺胺类药物分离：磺胺类药物具有两性特征，是测试HILIC/WAX混合模式的理想对象。研究优化了流动相中有机相比例、缓冲盐浓度和温度。发现了一个有趣的现象：在一定的缓冲浓度下，某些磺胺类药物的保留随温度升高而增加（表现为Van’t Hoff图中斜率为正）。作者推测这可能是由于温度升高改变了分析物的酸度常数（pKa）和固定相的碱度，从而增强了离子交换作用。最终，在梯度洗脱条件下，实现了9种治疗性磺胺类药物的基线分离。

四、 主要研究结果

1. 成功合成高稳定性交联氨基硅胶：通过硅杂环戊烷化学和后续的交联反应，成功制备了一种表面具有环状酰胺-氨基丙基网络结构的新型固定相。固态NMR和元素分析数据为合成成功提供了确凿证据。
2. 水解稳定性显著提升：加速老化测试结果明确显示，新型交联氨基相的水解稳定性远超传统的刷型氨基相（APTES-SP, Classical APS），甚至优于硅杂环戊烷制备的未交联氨基相（APS-SP8）。经过50小时严苛条件处理后，其色谱保留仅初始阶段有小幅下降（归因于未交联配体的去除），随后保持稳定，氮含量损失几乎可忽略不计。其稳定性与商品化的聚合物氨基柱（Polymeric APS）和实验室自制的交联PEI相相当。
3. 保留了经典氨基相的色谱特性：尽管经过了交联且碳含量较高（~10.7%），新固定相在RPC模式下未显示明显的疏水保留，证实其强亲水表面。在HILIC和WAXC模式下，它表现出与经典氨基相似的保留机制和选择性，具备有效的阴离子交换容量。PCA分析进一步确认其在色谱保留空间中的位置与经典氨基相近。
4. 展示了优异的实际分离能力：该固定相能够高效分离糖类和复杂的磺胺类药物混合物。特别是在磺胺类药物的分离中，展现出在HILIC/WAX混合模式下良好的选择性和耐受升高的柱温的能力，这为其在方法开发中提供了额外的灵活性。
5. 阐明了稳定性提升的机理：通过对比不同合成路线的材料，研究证实：a) 使用硅杂环戊烷前体可显著提高氨基丙基配体的三官能键合比例，这是提升基础键合稳定性的有效策略；b) 进一步的交联步骤形成了共价网络，将配体“锁定”在表面，从根本上防止了单个硅氧烷键水解导致的配体整体脱落，这是获得卓越稳定性的关键。

五、 研究结论与价值

本研究成功开发并深入探索了一种新型的、具有卓越水解稳定性的交联氨基硅胶固定相。该材料通过创新的合成策略，将硅杂环戊烷化学的高效键合与交联网络的稳定作用相结合，有效解决了长期困扰经典氨基固定相的水解不稳定性问题。

科学价值：本研究不仅提供了一种性能优异的实用材料，更深入揭示了通过表面化学工程提升硅胶键合固定相稳定性的有效路径。系统性的表征方法（特别是固态NMR）和严谨的稳定性测试方案，为未来固定相的开发与评价提供了范例。

应用价值：该新型固定相有望直接替代传统氨基柱，应用于需要高稳定性、长柱寿命和低质谱背景噪声的色谱分析中，例如药物质量控制中极性化合物（如糖类、核苷、氨基酸、磺胺类药物）的常规分析、代谢组学研究和生物制药领域。其良好的耐温性也为在高温下进行快速分离提供了可能。

六、 研究亮点

1. 创新性的合成设计：首次报道了通过三缩水甘油基异氰脲酸酯交联表面氨基丙基，构建稳定酰胺-氨基网络结构的方法，构思巧妙。
2. 卓越的性能平衡：成功实现了超高水解稳定性与经典氨基相色谱性能的完美平衡，解决了该领域长期存在的矛盾。
3. 系统深入的机理研究：从分子层面（固态NMR揭示键合状态）到宏观性能（色谱测试与稳定性评估），对材料进行了多层次、多角度的系统表征，结论扎实可靠。
4. 全面的色谱性能评估：不仅在常规模式下测试，还通过PCA在更广阔的固定相空间中进行定位，并通过具有挑战性的实际样品分离验证了其应用潜力。
5. 清晰的对比论证：通过设置包括商品化产品、不同合成路线的自制相在内的多个对照组，使稳定性与性能的提升效果和原因一目了然。

七、 其他有价值内容

研究中关于磺胺类药物分离时出现的“保留随温度升高而增加”的反常现象，作者并未简单带过，而是给出了基于热力学（熵控）或分析物/固定相酸碱性随温度变化（pKa位移）的合理解释。这种对非常规现象的深入探讨，体现了研究的严谨性和深度，也为后续研究者提供了有价值的思考方向。此外，论文中详尽的补充信息（Supporting Information）包含了合成细节、NMR参数、大量色谱条件与数据等，具有很高的参考价值。