本文发表于 *Journal of Ethnopharmacology*（293卷，文章编号115283），在线发表日期为2022年4月12日。该研究由中央民族大学药学院民族药教育部重点实验室的研究人员完成，主要作者包括Hongjuan Niu、Lu Fan、Linyi Zhao、Rongfei Yao、Xu He，通讯作者为Binan Lu和Zongran Pang。Hongjuan Niu和Lu Fan为共同第一作者。该研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号82074394）的资助。

研究背景与目的

糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常见且严重的微血管并发症之一，以系膜基质扩张、肾小管间质纤维化和肾小球结节性硬化为主要病理特征。DN不仅是终末期肾病的主要病因，也是心血管疾病的独立危险因素。目前临床治疗主要集中于改善高血糖、高血压和血脂异常，但针对病因及多靶点的治疗策略仍十分有限。传统中药在DN治疗中显示出良好的安全性和有效性。Purendan（PRD）是一种临床用于防治糖尿病的中药复方，源自《伤寒论》中治疗“消渴病”的方剂，具有滋阴清热、生津止渴的功效。PRD由苦瓜、人参、丹参、何首乌和葛根五味中药组成，均为药食同源物质。既往临床和动物实验已证实PRD对糖尿病及其并发症具有治疗作用，但其治疗DN的具体药理机制尚不明确。本研究旨在通过网络药理学预测和实验验证，系统探讨PRD治疗DN的作用机制，重点关注其调控的关键靶点和主要信号通路。

研究流程与方法

研究共包括三个主要步骤：网络药理学分析、数据库验证与分子对接/表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）亲和力验证、以及动物实验验证。

首先，在活性成分筛选方面，研究团队从TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM、TCM-Mesh和ETCM五个公共数据库中收集PRD五味药材的化学成分，经过去重后初步获得640个成分。随后按照口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%和类药性（drug-likeness, DL）≥0.18的ADME标准进行筛选，最终获得91个候选活性化合物。这些化合物进一步通过QSAR-TargetNet和SwissTargetPrediction数据库预测相关靶点，共得到763个成分相关靶点。DN疾病相关靶点则从GeneCards、CTD和TTD数据库中获得，共筛选出539个疾病靶点。将成分靶点与疾病靶点取交集后，得到137个PRD治疗DN的候选靶点。基于这些候选靶点，构建了“药材-化合物-靶点”网络，共包含228个节点和1070条边。

在蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析中，利用STRING数据库构建PPI网络，物种限定为人类，置信度设为0.700。网络包含137个节点和715条边，平均节点度为10.4。通过Cytoscape 3.8软件的CytoHubba插件进行拓扑学分析，根据度中心性（degree centrality, DC）、介数中心性（betweenness centrality, BC）和紧密度中心性（closeness centrality, CC）三个参数筛选枢纽靶点。最终获得16个关键靶点，其中STAT3、AKT1、MAPK3、SRC和TNF五个靶点在三种拓扑参数筛选中均重叠出现。同时通过MCODE分析识别出两个重要模块：模块A（评分8.000）包含21个靶点和80条边，模块B（评分7.429）包含15个靶点和52条边。

在功能富集分析方面，利用clusterProfiler R包对137个候选靶点进行GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析。GO分析共获得2481个生物过程条目、23个细胞组分条目和174个分子功能条目。KEGG分析共获得172条通路，其中“脂质与动脉粥样硬化通路”（hsa05417）和“糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路”（hsa04933）排名前两位，且均富集了STAT3、AKT1和MAPK3三个关键靶点。

第二步是数据库验证和分子对接/SPR分析。在GEO数据库（Gene Expression Omnibus）中下载GSE96804数据集，该数据集基于GPL17586平台，包含41例DN患者和20例正常对照的肾组织表达数据。差异表达分析显示1255个上调基因和654个下调基因。16个关键靶点中有10个在DN组和对照组之间存在显著表达差异。分子对接使用AutoDock Vina进行，蛋白晶体结构来自PDB数据库，化合物二维结构来自PubChem数据库。结果显示大多数靶点蛋白与对应化合物之间存在良好的结合能。SPR实验在Biacore T200仪器上进行，结果表明山奈酚（kaempferol）与AKT1的解离常数（KD）为3.37 μM，大黄酸（rhein）与MAPK3的KD为8.96 μM，验证了活性成分与靶点蛋白之间的良好亲和力。

第三步是动物实验验证。选用13月龄雄性Sprague-Dawley大鼠，体重500±50 g，采用高糖高脂饲料喂养8周后腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）20 mg/kg建立DN模型。模型建立后，将大鼠随机分为6组（每组9只）：对照组、模型组、二甲双胍组（0.14 g/kg）、PRD低剂量组（3.375 g/kg）、PRD中剂量组（6.75 g/kg）和PRD高剂量组（13.5 g/kg）。药物干预持续4周。每周测定空腹血糖，第4周进行口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test, OGTT）。实验结束后采集血液和肾组织样本，进行组织病理学检查（HE、PAS和Masson染色）、生化指标检测（血清肌酐、尿素氮、总胆固醇、总甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、超氧化物歧化酶和丙二醛）以及Western blotting检测STAT3、AKT1和MAPK3蛋白表达水平。

主要研究结果

网络药理学分析共筛选出137个PRD治疗DN的候选靶点。在这些靶点中，TNF、STAT3、AKT1、SRC、MAPK3、IL1B、MAPK1、CASP3和VEGFA等表现出较高的度值。GO富集分析显示这些靶点主要富集于肽基丝氨酸修饰、膜筏和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等功能条目。KEGG富集分析显示“脂质与动脉粥样硬化通路”和“糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路”为最显著富集的两条通路，且均包含STAT3、AKT1和MAPK3三个枢纽靶点。

GEO数据库验证结果显示，在GSE96804数据集中，CASP3、MAPK8、PPARG、STAT3和AKT1在DN组中显著高表达，而IL1B、MAPK1、MAPK3、PPARA和VEGFA的表达则相反，表明这些关键基因与DN的发生发展密切相关。

分子对接结果显示大多数靶点蛋白与对应化合物之间存在良好的结合能。SPR亲和力实验证实山奈酚与AKT1的KD值为3.37 μM，大黄酸与MAPK3的KD值为8.96 μM，表明PRD中的活性成分能够与关键靶点蛋白直接结合。

动物实验结果显示，高糖高脂饮食联合STZ注射成功建立了DN模型，模型组大鼠血清葡萄糖、胰岛素水平显著升高，肾功能指标（肌酐和尿素氮）明显异常，肾组织出现肾小球肿胀、上皮细胞空泡化、淋巴细胞和单核细胞浸润、细胞外基质沉积、肾小球和肾间质纤维化以及肾小管透明管型等病理改变。PRD治疗4周后，血清葡萄糖和胰岛素抵抗显著改善，肾功能指标明显恢复，肾脏病理损伤得到不同程度的缓解。

在氧化应激方面，模型组超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性显著降低，丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量显著升高；PRD治疗可提高SOD活性并降低MDA含量。在脂质代谢方面，模型组总甘油三酯（total triglycerides, TG）、总胆固醇（total cholesterol, TC）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）水平显著升高，高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C）水平显著降低；PRD治疗能够显著改善这些脂质代谢指标。Western blotting结果显示，模型组STAT3、AKT1和MAPK3蛋白表达水平均显著升高，PRD治疗后这三个蛋白的表达水平均显著降低。

研究结论与意义

本研究通过网络药理学预测、数据库验证、分子对接/SPR亲和力验证和动物实验验证，系统阐明了PRD治疗DN的作用机制。结果表明，PRD可能通过多种活性成分作用于AKT1、MAPK3和STAT3等关键靶点，调控AGE-RAGE信号通路和脂质代谢信号通路，从而发挥改善氧化应激和脂质代谢紊乱的治疗作用。该研究为PRD治疗DN提供了科学依据，也为中药复方多成分、多靶点、多通路作用机制的研究提供了方法学参考。研究中所筛选的大量靶点和通路为PRD治疗DN的后续研究指明了方向。此外，研究中选择老龄大鼠建立DN模型，更符合临床流行病学特征，具有较好的转化医学价值。

研究亮点

该研究的亮点主要体现在以下几个方面：首先，采用了网络药理学、生物信息学验证、分子对接与SPR实验相结合的多层次策略，从系统层面和分子层面共同验证了PRD的作用机制；其次，通过GEO数据库的独立数据集验证了关键靶点与DN的临床相关性，增强了研究结论的可靠性；第三，在动物实验中同时检测了氧化应激和脂质代谢两类指标，验证了PRD对两条主要信号通路的调控作用；第四，研究所用的PRD复方五味药材均为药食同源物质，具有良好的安全性基础，为其临床应用提供了有利条件。