本研究由保定市第一中心医院内分泌科的Liqin Li、Lili Jin、Jun Wang以及承德医学院研究生院内分泌科的Yaping Tian共同完成，其中Liqin Li和Lili Jin为共同第一作者，Jun Wang为通讯作者。该论文发表于 Molecular Medicine Reports 期刊，2025年卷31，文章编号111，DOI为10.3892/mmr.2025.13476。
一、研究背景与目的
冠状动脉疾病是心血管疾病中最常见的类型，及时恢复血流灌注是主要的治疗手段，然而再灌注本身可加重心肌缺氧/复氧损伤。缺血/再灌注损伤涉及活性氧过度产生、细胞凋亡以及线粒体动力学失衡等多种机制。自噬作为一种降解和回收受损细胞器及蛋白质的细胞过程，在调控心肌细胞存活中发挥关键作用，但其在缺氧/复氧损伤中的精确调控机制尚未完全阐明。线粒体自噬是维持心肌稳态的重要过程，其中PINK1/Parkin通路是调控线粒体自噬最主要的途径。Semaglutide是一种胰高血糖素样肽-1受体激动剂，已在既往研究中显示出心脏保护效应，但其对缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤的具体分子机制仍不清楚。因此，本研究旨在利用人AC16心肌细胞体外缺氧/复氧模型，探讨semaglutide是否通过调节ROS/PINK1/Parkin/P62通路增强线粒体自噬从而减轻氧化应激损伤，为心肌缺血/再灌注损伤的治疗提供新的理论依据。
二、研究流程与方法
本研究以人AC16心肌细胞为研究对象，通过缺氧8小时后再复氧12小时建立体外缺氧/复氧模型。首先，为了确定semaglutide的安全浓度范围，研究者使用CCK-8法检测不同浓度semaglutide在常氧条件下对AC16细胞活力的影响。结果显示随着浓度升高细胞增殖率下降，因此选择1.25、2.5、5和10 mmol/L这些无毒浓度用于后续实验。随后，在缺氧/复氧条件下进行剂量反应实验，发现5 mmol/L semaglutide处理48小时可最大程度提高细胞活力，故该条件被确定为最适处理参数。实验共分为五组：常氧对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+semaglutide组、缺氧/复氧+semaglutide+rapamycin（自噬诱导剂）组，以及缺氧/复氧+semaglutide+3-甲基腺嘌呤（3-MA，自噬抑制剂）组。
在建立了稳定的实验分组后，研究者进行了多项检测以全面评估semaglutide的心肌保护作用及其机制。细胞活力通过CCK-8实验检测，ATP水平采用生物发光检测试剂盒测定，活性氧生成使用ROS检测试剂盒通过DCFH-DA荧光探针在荧光显微镜下观察。自噬体的形态学观察采用透射电子显微镜进行，样本经过戊二醛和四氧化锇固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋、超薄切片以及铀铅双染色后观察自噬体数量。此外，还利用mRFP-GFP-LC3串联荧光腺病毒系统结合共聚焦显微镜评估自噬流状态，其原理是GFP荧光在酸性溶酶体环境中淬灭而mRFP荧光保持稳定，黄色斑点代表自噬体，红色斑点代表自噬溶酶体。蛋白表达水平采用Western blot分析，检测的自噬标志物包括LC3、P62和Beclin1，线粒体自噬调节蛋白包括PINK1和Parkin。所有实验重复三次，数据以均数±标准误表示，多组比较采用单因素方差分析及Tukey事后检验。
三、主要实验结果
在细胞活力和能量代谢方面，CCK-8实验表明semaglutide在5 mmol/L浓度下显著改善缺氧/复氧导致的细胞活力下降。ATP检测结果显示，缺氧/复氧导致AC16细胞ATP水平显著降低，而semaglutide处理可显著逆转这一效应，使ATP含量大幅增加。当联合使用rapamycin时，ATP含量进一步升高；而加入自噬抑制剂3-MA则导致ATP水平显著降低，这提示semaglutide的保护作用可能依赖于自噬的激活。
在氧化应激方面，ROS检测显示缺氧/复氧暴露使细胞内ROS水平显著升高，而semaglutide处理能显著降低ROS荧光强度，表明其具有抗氧化损伤能力。与单独使用semaglutide相比，联合rapamycin可进一步降低ROS水平，而加入3-MA则导致ROS水平重新升高，这进一步支持了自噬在semaglutide抗氧化应激中的关键作用。
在自噬体形态学方面，透射电子显微镜观察发现，缺氧/复氧组细胞中自噬体数量较对照组明显增多，而semaglutide处理使自噬体数量进一步增加。semaglutide联合rapamycin组自噬体形成最为显著，而加入3-MA则部分逆转了自噬体积累，这从形态学层面证实了semaglutide能增强缺氧/复氧条件下的自噬活性。
在自噬流动态监测方面，共聚焦显微镜分析mRFP-GFP-LC3荧光显示，缺氧/复氧组中自噬体黄色斑点数量增加，semaglutide处理组中黄色和红色斑点均显著增多，表明自噬体和自噬溶酶体数量都增加，自噬流顺畅。rapamycin联合处理进一步增加了自噬体数量，而3-MA处理则显著减少了自噬体数量，这从功能层面证实了semaglutide可激活自噬流。
在PINK1/Parkin通路方面，Western blot结果显示缺氧/复氧使Parkin和PINK1蛋白水平显著升高，而semaglutide处理可进一步上调两者的表达水平。与semaglutide单独处理相比，rapamycin联合组中PINK1和Parkin表达进一步升高，而3-MA组则显著降低。
在自噬标志物方面，缺氧/复氧使LC3B-II/LC3B-I比值以及Beclin1和P62表达水平均显著升高。semaglutide处理进一步增强了这些蛋白的表达水平，rapamycin联合处理产生了最强的促进作用，而3-MA则降低了它们的表达。值得注意的是，本研究观察到在semaglutide组中LC3B-II/LC3B-I比值升高的同时P62水平也升高，这与经典的自噬降解模型中P62随自噬激活而降低的现象不一致。研究者在讨论部分对此进行了解释：P62作为自噬底物蛋白，在氧化应激条件下其表达可被转录因子Nrf2通过抗氧化反应元件直接上调，同时P62作为应激响应蛋白可因氧化挑战而被诱导表达。因此，在氧化应激背景下自噬激活与P62升高可以共存，P62水平的升高并不一定反映自噬流通畅程度，而全面评估自噬流需要综合自噬体形成、溶酶体融合和底物降解等多阶段指标。
四、研究结论与价值
本研究首次系统阐明了semaglutide在缺氧/复氧诱导的AC16心肌细胞损伤中通过减少氧化应激和增强PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬来发挥保护作用。具体而言，semaglutide可降低ROS水平、提高ATP含量、增强自噬活性，并上调PINK1、Parkin、LC3B-II/LC3B-I、Beclin1和P62等自噬相关蛋白的表达。这些效应可被rapamycin增强、被3-MA抑制，进一步证实了semaglutide的保护机制依赖自噬的激活。本研究的科学价值在于为semaglutide的心脏保护效应提供了具体的线粒体自噬分子通路依据，提出ROS/PINK1/Parkin/P62通路上游的调控模式；应用价值在于提示semaglutide在心肌缺血/再灌注损伤治疗中的潜力，为临床转化提供了实验基础。
五、研究亮点与局限
本研究的亮点包括：利用mRFP-GFP-LC3串联荧光系统动态监测自噬流而非仅检测静态自噬标志物；通过自噬诱导剂rapamycin和自噬抑制剂3-MA的正反向干预确立自噬在semaglutide保护效应中的因果关系；将semaglutide的保护机制与PINK1/Parkin线粒体自噬通路明确关联。同时，研究者也坦诚指出了局限性：仅使用单一AC16细胞系，未开展原代心肌细胞或动物在体实验；未设置单独的缺氧/复氧+rapamycin或3-MA对照组；未能进行PINK1/Parkin基因敲除以排除其他通路如AMPK通路的作用；未检测GLP-1受体蛋白在各组中的表达水平。研究者强调，对自噬的精确调控需要在过度激活与不足之间取得平衡，提示未来需要进一步探索最佳的干预时机和方式。