本研究由Chunjie Gu、Yang Liu、Xiuli An、Gang Yin和Chenghe Sun等人完成，通讯作者为Chenghe Sun。研究单位包括齐齐哈尔市第一医院神经内科（Department of Neurology, The First Hospital of Qiqihar）、齐齐哈尔市第一医院风湿免疫科（Department of Rheumatology, The First Hospital of Qiqihar）以及哈尔滨市第二医院神经内科（Department of Neurology, The Second Hospital of Harbin）。该研究发表于《Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases》第33卷（2024年），文章编号为107668，于2024年2月27日在线发表。
卒中（stroke）是全球范围内导致死亡和严重残疾的主要原因之一，其中缺血性卒中（ischemic stroke，IS）占绝大多数。在急性缺血性卒中发生后，脑组织因血流供应不足首先出现可逆性功能丧失，随后进展为神经元死亡和梗死形成。目前临床上仍急需能够在血管再通前及再通过程中发挥神经保护作用的治疗药物，以延长干预时间窗并改善患者预后。
小窝蛋白-1（Caveolin-1，CAV1）是一种定位于小窝膜上的整合膜蛋白，分子量约21–24 kDa。既往研究表明CAV1在缺血性卒中中具有神经保护作用，包括减少神经炎症、促进神经再生和血管新生、抑制细胞凋亡等。然而，CAV1在缺血性卒中中的上游调控机制尚不清楚。有研究发现，CAV1蛋白稳定性可受到E3泛素连接酶的调控。由于泛素化修饰在脑缺血后显著增强，本研究旨在寻找缺血性卒中中调控CAV1表达的E3泛素连接酶，并进一步探索其上游转录调控机制。
研究团队通过数据库筛选发现E3泛素连接酶Synoviolin（SYVN1，又称HRD1）在缺血性卒中中差异表达。SYVN1是一种定位于内质网的E3泛素连接酶，参与内质网相关蛋白降解（ERAD）途径。本研究使用大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠模型和氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）细胞模型，系统探讨了SYVN1是否通过调控CAV1泛素化修饰参与缺血性卒中进展，并揭示了SYVN1异常激活的上游机制。
本研究主要包括以下实验程序：
1. E3泛素连接酶筛选与生物信息学分析
研究团队首先利用UbiBrowser 2.0数据库预测以CAV1为底物的E3泛素连接酶。同时从GEO数据库下载GSE140275数据集（中国南方汉族人群急性缺血性卒中循环长链非编码RNA和mRNA表达谱），以adj. P < 0.01且|log2FC| > 1为阈值筛选差异表达基因。将差异表达基因与CAV1的E3泛素连接酶取交集，共得到14个交集基因。KEGG通路富集分析显示这些基因主要富集于泛素介导的蛋白水解、内吞作用、内质网蛋白质加工等通路。其中SYVN1同时富集于泛素介导的蛋白水解和内质网蛋白质加工通路，且在急性缺血性卒中患者全血中表达显著升高（logFC = 1.3070923），因此被选为进一步研究对象。
2. MCAO小鼠模型建立与SYVN1表达验证
使用雄性C57BL/6J小鼠（25–30 g）建立MCAO模型。实验分组包括假手术组（sham）、MCAO组、MCAO + sh-NC组、MCAO + sh-SYVN1组、MCAO + oe-NC组、MCAO + oe-RAD21组、MCAO + oe-RAD21 + oe-NC组和MCAO + oe-RAD21 + oe-SYVN1组，每组15只。通过神经功能评分、TTC染色测定脑梗死体积、脑含水量测定、RT-qPCR和Western blot检测SYVN1和CAV1表达。结果显示MCAO小鼠神经功能评分升高、梗死体积增加、脑含水量升高，SYVN1在mRNA和蛋白水平均上调，而CAV1蛋白表达下降。
3. SYVN1调控CAV1泛素化修饰的体外实验
将sh-NC或sh-SYVN1转染至小鼠HT22海马神经元细胞，随后进行OGD处理。通过RT-qPCR检测SYVN1和CAV1 mRNA表达，Western blot检测CAV1蛋白表达，免疫共沉淀（Co-IP）检测SYVN1对CAV1的泛素化修饰，蛋白半衰期实验（使用放线菌酮CHX抑制蛋白合成）检测CAV1降解速率。结果显示，沉默SYVN1虽然不改变CAV1 mRNA水平，但可恢复CAV1蛋白表达；SYVN1能够结合并催化CAV1泛素化；sh-SYVN1处理可减缓CAV1蛋白降解。
4. SYVN1下调对MCAO小鼠脑损伤的保护作用评估
通过脑立体定位注射慢病毒载体（sh-NC或sh-SYVN1）至小鼠脑内，4天后进行MCAO造模。注射后检测神经功能评分、SYVN1 mRNA表达、脑梗死体积、脑含水量、SYVN1和CAV1蛋白表达。同时进行尼氏染色（Nissl staining）观察尼氏小体数量，TUNEL法检测细胞凋亡，ELISA检测血清IL-1β和IL-18水平，HE染色观察脑组织结构。结果表明sh-SYVN1可降低神经功能评分、减少梗死体积和脑水肿、抑制细胞凋亡和炎症反应、改善脑组织结构。
5. CAV1在SYVN1功能中的下游作用验证
HT22细胞分别转染sh-NC、sh-SYVN1、sh-SYVN1 + oe-NC或sh-SYVN1 + oe-CAV1，再进行OGD处理。通过Western blot检测CAV1表达，CCK-8检测细胞活力，Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡，ELISA检测IL-1β和IL-18水平。结果显示过表达CAV1可进一步增强sh-SYVN1对OGD诱导的HT22细胞损伤的保护作用。
6. RAD21作为SYVN1上游转录因子的筛选与验证
利用hTFtarget数据库和GeneCards数据库预测调控SYVN1的转录因子，并与GSE140275差异表达基因取交集，得到27个候选基因。进一步分析发现RAD21在缺血性卒中患者中下调最为显著（logFC = -2.1560241）。Cistrome DB数据库的ChIP-seq数据显示RAD21在SYVN1启动子区域存在显著结合峰。在MCAO小鼠脑组织和OGD处理的HT22细胞中验证RAD21表达下调。通过ChIP实验证实RAD21可直接结合SYVN1启动子；双荧光素酶报告基因实验证实RAD21上调可抑制SYVN1启动子活性。
7. RAD21通过抑制SYVN1转录发挥神经保护作用的验证
HT22细胞转染oe-NC、oe-RAD21、oe-RAD21 + oe-NC或oe-RAD21 + oe-SYVN1后进行OGD处理。通过RT-qPCR检测SYVN1表达，CCK-8检测细胞活力，Annexin V-FITC/PI检测凋亡，Western blot检测CAV1表达，ELISA检测炎症因子，EdU染色检测细胞增殖。小鼠体内实验同样设置上述四组，进行神经功能评分、TTC染色、脑含水量测定、尼氏染色、TUNEL、HE染色和免疫组织化学检测。
1. SYVN1在MCAO小鼠脑组织中高表达
与sham组相比，MCAO小鼠SYVN1 mRNA和蛋白水平均显著升高，而CAV1蛋白表达下降。TTC染色显示MCAO小鼠脑梗死体积明显增加，脑含水量显著升高，神经功能评分升高，表明MCAO模型成功建立且SYVN1在缺血性脑损伤中上调。
2. SYVN1通过泛素化修饰调控CAV1蛋白稳定性
在OGD处理的HT22细胞中，SYVN1表达升高而CAV1表达降低。沉默SYVN1虽然不影响CAV1 mRNA水平，但可显著恢复CAV1蛋白表达。Co-IP实验证实SYVN1与CAV1存在直接结合并可催化CAV1泛素化。蛋白半衰期实验显示sh-SYVN1处理可明显减缓CAV1蛋白降解速率，证明SYVN1通过促进CAV1泛素化降解来降低其蛋白水平。
3. SYVN1下调减轻MCAO小鼠脑损伤
sh-SYVN1处理可显著降低MCAO小鼠神经功能评分、减少脑梗死体积和脑含水量。Western blot显示sh-SYVN1降低SYVN1蛋白表达的同时升高CAV1蛋白表达。尼氏染色显示sh-SYVN1恢复尼氏小体数量；TUNEL显示sh-SYVN1减少凋亡细胞；ELISA显示血清IL-1β和IL-18水平下降；HE染色显示脑组织结构更完整、炎症浸润减少。这些结果表明SYVN1下调可减轻缺血性卒中后的脑损伤和炎症反应。
4. CAV1是SYVN1在缺血性卒中中的功能性下游靶点
在OGD处理的HT22细胞中，过表达CAV1可进一步增强sh-SYVN1的保护效应，表现为细胞活力进一步提高、凋亡率进一步降低、炎症因子水平进一步下降。这证实CAV1是SYVN1发挥促损伤作用的关键底物。
5. RAD21下调是缺血性卒中中SYVN1过表达的原因
MCAO小鼠脑组织和OGD处理的HT22细胞中RAD21表达均显著下调。过表达RAD21可抑制SYVN1转录，同时恢复CAV1蛋白表达，但对CAV1 mRNA无影响。ChIP实验证实RAD21可直接结合SYVN1启动子区域；双荧光素酶报告基因实验显示RAD21过表达可显著降低SYVN1启动子活性。这些结果表明RAD21作为转录抑制因子负调控SYVN1表达，在缺血性卒中中RAD21下调导致SYVN1转录去抑制，从而升高SYVN1水平。
6. RAD21过表达通过抑制SYVN1发挥神经保护作用
在体外OGD模型和体内MCAO模型中，RAD21过表达均可减轻细胞损伤和脑损伤，表现为细胞活力升高、凋亡减少、炎症反应降低、脑梗死体积减小、脑水肿减轻、尼氏小体数量恢复。然而，同时过表达SYVN1可逆转RAD21的保护效应，表现为SYVN1表达升高、CAV1蛋白下降、神经功能评分升高、梗死体积和脑含水量增加。这表明SYVN1是RAD21在缺血性卒中中的功能性下游效应分子。
本研究首次揭示了RAD21/SYVN1/CAV1信号轴在缺血性卒中中的调控机制。具体而言，RAD21作为转录抑制因子可直接结合SYVN1启动子并抑制其转录。在缺血性卒中条件下，RAD21表达下调导致SYVN1转录去抑制，SYVN1表达升高。SYVN1作为E3泛素连接酶，通过催化CAV1泛素化修饰促进其蛋白酶体降解，从而降低CAV1蛋白水平。CAV1作为神经保护因子，其蛋白水平降低导致神经元凋亡增加、神经炎症加重，最终加剧缺血性脑损伤。
该研究具有重要的科学价值和应用价值。从科学角度看，首次阐明了缺血性卒中中CAV1蛋白下调的上游分子机制，丰富了缺血性卒中神经损伤的分子调控网络，为理解卒中后神经炎症和细胞凋亡的调控提供了新的理论视角。从应用角度看，RAD21/SYVN1/CAV1轴中的关键分子有望成为缺血性卒中神经保护的潜在治疗靶点。靶向抑制SYVN1或恢复RAD21功能可能为开发新型神经保护药物提供新策略，有助于延长再通治疗的时间窗并改善患者预后。
首次揭示RAD21/SYVN1/CAV1信号轴：本研究首次将转录因子RAD21、E3泛素连接酶SYVN1和底物CAV1串联起来，完整展示了一条从转录调控到翻译后修饰的缺血性卒中神经损伤调控通路。
多数据库整合筛选策略：研究巧妙结合UbiBrowser、GEO、hTFtarget、GeneCards和Cistrome DB等多个数据库，通过交叉筛选高效锁定SYVN1和RAD21，体现了系统生物学和生物信息学在机制研究中的应用价值。
体内外双重验证：研究同时使用MCAO小鼠模型和OGD细胞模型，通过遗传操纵（慢病毒介导的基因沉默和过表达）在功能层面验证了分子机制，增强了研究结论的可靠性和转化潜力。
聚焦翻译后修饰调控：研究关注泛素化修饰在缺血性卒中中的作用，为探索缺血性卒中的表观遗传和翻译后调控机制提供了新视角。