本文发表于 Cell 期刊（2023年8月17日），主要作者为 Benjamin Ruf, Matthias Bruhns, Sepideh Babaei 等人，资深作者为 Tim F. Greten，主要研究机构包括美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所（National Cancer Institute）和德国图宾根大学（University of Tübingen）等。这是一项关于肝细胞癌（HCC）免疫微环境的原创性研究，揭示了黏膜相关恒定T细胞（MAIT细胞）在肝癌中的功能障碍机制及其与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的相互作用。
研究背景与科学问题
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是一种典型的炎症驱动型癌症，其肿瘤免疫微环境（TIME）的细胞组成深刻影响着肿瘤的发生、进展和治疗反应。免疫检查点阻断（ICB）疗法已用于晚期HCC的治疗，但仅对部分患者有效，部分原因在于抑制性的TIME削弱了常规T细胞的功能。MAIT细胞（mucosal-associated invariant T cells）是一类MR1限制性的固有样T细胞，能够识别来源于微生物维生素B2代谢产物的非肽类抗原。值得注意的是，MAIT细胞在健康人肝脏中极为丰富，可占肝内T细胞的45%，但在小鼠体内则极其稀少。MAIT细胞在肿瘤中的角色尚存争议：有研究显示其与HCC预后不良相关，而在胆管癌中则与良好预后有关。功能研究也揭示了其“双刃剑”特性——既可能具有致病性，也可能在特定激活条件下发挥抗肿瘤作用。然而，决定MAIT细胞在肝癌中功能命运的因素，尤其是TIME内哪些细胞互作网络使其功能受损，此前几乎完全未知。本研究旨在系统解析HCC中MAIT细胞的异质性与功能障碍，并揭示驱动其功能失调的关键细胞互作机制。
研究设计与实验流程
为达成此目标，研究者设计了一个多层面、系统性的研究流程，整合了多个先进技术平台与多种样本类型。
首先，研究者对8例HCC患者的配对样本（肿瘤组织与癌旁肝组织）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），以绘制HCC的整体免疫图谱并鉴定MAIT细胞亚群。为深入探究MAIT细胞的异质性，他们进一步通过荧光激活细胞分选（FACS）富集了上述患者中的MAIT细胞，并单独对这部分细胞进行了scRNA-seq分析。同时，研究者应用高维流式细胞术对37例HCC患者的配对组织样本进行了验证，检测了MAIT细胞表面活化/功能障碍标志物（如PD-1、CD25、CD56等）的表达变化。
其次，为在组织原位解析MAIT细胞的微环境，研究者引入了一项关键的新技术——联合索引共检测（CODEX）多重荧光成像。他们设计并验证了一个包含37种寡核苷酸标记抗体的方案，对15例HCC患者（其中8例与scRNA-seq队列匹配）的全组织切片进行了成像，范围涵盖了癌旁肝、肿瘤侵袭边缘（rim）和肿瘤核心。这构建了一个空间解析的人类肝癌免疫细胞图谱。基于此数据，研究者应用了一种名为“监督式空间单细胞成像分析”（s3-cima）的定制化机器学习算法。该方法采用卷积神经网络（CNN）架构，通过分析MAIT细胞周围邻近细胞的空间分布特征，识别其在不同组织区域中的特征性细胞邻域，从而鉴定与MAIT细胞发生重要互作的细胞群。
之后，为验证计算分析发现并探究机制，研究者开展了体外与体内功能实验。在体外，他们建立了一个基于患者新鲜样本的共培养系统，将分选出的肝源性MAIT细胞与表达PD-L1的CD163+巨噬细胞共同培养，并加入抗PD-L1阻断性抗体，以评估巨噬细胞对MAIT细胞功能的抑制效应及PD-1/PD-L1通路的作用。在体内，研究者使用了多种原位肝癌小鼠模型，包括RIL-175、Hep55.1C、MC38和B16-F10等细胞系，并利用MR1基因敲除（Mr1-/-）小鼠、巨噬细胞特异性耗竭模型（MMDTR小鼠）、条件性基因敲除小鼠（如Csf1rCreCd274 fl/fl）以及PD-L1阻断疗法，系统地测试了TAMs对MAIT细胞浸润和细胞毒功能的因果影响。最后，为评估其临床转化潜力，研究者分析了一个独立的、来自ICB治疗的HCC患者队列的scRNA-seq数据，观察MAIT细胞在治疗前后的变化。
主要研究结果
MAIT细胞在HCC中的浸润缺陷与功能障碍：scRNA-seq、流式细胞术及CODEX成像数据显示，与癌旁肝脏相比，HCC肿瘤内的MAIT细胞数量显著减少，但在肿瘤浸润边缘有所聚集。空间分析进一步揭示了这种浸润能力受损的动态过程。重要的是，肿瘤内的MAIT细胞展现出异常活化和功能失调的表型，表现为PD-1、CD25和HLA-DR表达上调，而NK细胞标志物CD56表达下调。这一发现在小鼠模型中得到了完美复现：多种原位肝癌小鼠模型中，肿瘤内MAIT细胞数量同样减少，且肝内MAIT细胞获得了一种晚期功能障碍表型（PD-1hi TIM-3hi），伴随Th1样（T-bet+ RORγt-）向Th17样（RORγt+ T-bet-）的表型转换，以及产生IFNγ、TNFα和颗粒酶B（Granzyme B）的能力显著丧失。
MAIT细胞功能障碍的关键触发因素——CSF1R+ PD-L1+ TAMs：S3-CIMA空间分析揭示了MAIT细胞功能障碍的关键调控因子。该算法精确鉴定出，在癌旁肝脏中，表达PD-L1的CD163+肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在MAIT细胞的邻域中特异性富集。CODEX图像直观展示了两者通过PD-1/PD-L1分子桥形成直接免疫突触的结构。流式细胞术和scRNA-seq联合分析证实，这些TAMs具有典型的免疫抑制性M2极化特征（CD163hi PD-L1hi CD206+），其频率和PD-L1表达水平在HCC患者中进一步增加。
PD-1/PD-L1轴介导TAMs对MAIT细胞的抑制作用：体外患者样本共培养实验证实，CD163+巨噬细胞能以细胞接触依赖的方式显著抑制MAIT细胞产生IFNγ，而加入抗PD-L1阻断抗体后，此抑制效应被部分解除。体内功能实验提供了决定性证据：在荷瘤小鼠中，使用MMDTR转基因小鼠或抗CSF1R抗体特异性地清除CSF1R+的巨噬细胞，不仅显著增加了浸润至肿瘤内的MAIT细胞数量，还恢复了其产生IFNγ、TNFα和颗粒酶B的能力。更重要的是，无论是给予全身性PD-L1阻断抗体，还是在巨噬细胞上条件性敲除Cd274基因（编码PD-L1），均能有效增强MAIT细胞的肿瘤浸润和细胞毒性功能。这些结果表明，CSF1R+ TAMs是造成MAIT细胞功能障碍的主要元凶，且此过程依赖于PD-1/PD-L1信号通路。
MAIT作为免疫检查点阻断疗法的潜在靶点：对接受ICB治疗的HCC患者的活组织切片进行的scRNA-seq分析显示，anti-PD-1/PD-L1治疗后，大多数患者的肿瘤内MAIT细胞比例出现扩增，且其细胞毒性评分（cytotoxicity score）显著升高。在小鼠模型中，将MAIT细胞的激活剂5-OP-Ru/CpG疗法与anti-PD-L1疗法联合使用，产生了协同性的肿瘤抑制效果，且此效果依赖于MAIT细胞的存在。这有力地证明了MAIT细胞是当前HCC免疫检查点阻断疗法的直接效应细胞之一。
结论与研究价值
本研究首次揭示了HCC中一个此前未被认识的免疫抑制轴——PD-L1+CSF1R+ TAMs通过与MAIT细胞的空间邻近互作，通过PD-1/PD-L1通路驱动其功能障碍和浸润缺陷。研究的科学价值在于：其一，系统性地描绘了MAIT细胞在人类HCC中的异质性和功能障碍图谱，并定义了从癌旁、侵袭边缘到肿瘤核心的功能状态连续体。其二，创新性地将高维空间成像技术CODEX与高级空间分析算法S3-CIMA相结合，从数据驱动角度发现了MAIT细胞微环境中的关键抑制性细胞。其三，通过从临床标本观察、体外机制验证到多种体内因果模型的完整证据链，证实了TAM-MAIT细胞免疫突触的关键调控作用。其应用价值在于，这些发现为HCC的免疫治疗提供了两个新视角：MAIT细胞不仅是anti-PD-1/PD-L1疗法的靶点，而且联合靶向TAMs（如抗CSF1R）可能进一步解除免疫抑制，从而增强MAIT细胞介导的抗肿瘤免疫。
研究亮点
本研究的亮点与创新性主要体现在以下几个方面。第一，技术的整合创新：通过将scRNA-seq、CODEX空间成像、S3-CIMA机器学习算法和传统免疫学方法有机结合，实现了从分子表达到空间定位再到细胞互作的功能解析，为研究免疫微环境提供了新范式。第二，发现了全新的细胞间调控关系：首次确认CSF1R+ PD-L1+ TAMs是MAIT细胞功能失调的关键“守门人”，并证明此免疫抑制过程起始于肝窦内，早于MAIT细胞进入肿瘤之前。第三，概念的转化：明确了MAIT细胞作为anti-PD-1/PD-L1疗法直接效应细胞的身份，为利用MAIT细胞开发新型免疫治疗组合策略铺平了道路。第四，方法学贡献：本文报道的37-plex CODEX肝脏组织成像方案和S3-CIMA空间分析策略为其他研究者提供了可复用的分析工具和思路。