类型a
主要作者与研究机构及发表信息
本研究的主要作者包括童超群（Chaoqun Tong）、魏俊红（Junhong Wei）、毛先兵（Xianbing Mao）、潘国庆（Guoqing Pan）、李春峰（Chunfeng Li）和周泽阳（Zeyang Zhou）。他们分别来自西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室、重庆微孢子虫感染与防控重点实验室、重庆迅时生物科技有限公司以及重庆师范大学生命科学学院。该研究于2023年4月20日发表在《PLOS ONE》期刊上。
学术背景
冬虫夏草（Chinese Cordyceps），又称为“冬虫夏草”，是一种传统中药，由寄生真菌Ophiocordyceps sinensis感染昆虫幼虫形成。近年来，冬虫夏草因其抗氧化、抗炎、降血糖和免疫调节等药理作用受到广泛关注。然而，由于其生长环境苛刻，野生冬虫夏草产量有限，因此人工培育成为研究热点。冬虫夏草的形成过程分为无性繁殖阶段（真菌在宿主血淋巴中增殖）和有性发育阶段（子实体形成与成熟）。为了研究这一复杂过程中的基因表达变化，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）被广泛使用。然而，RT-qPCR需要稳定的内参基因以校正实验误差，而目前尚无关于O. sinensis不同发育阶段和光照条件下稳定内参基因的研究。本研究旨在筛选适用于O. sinensis无性繁殖、子实体发育和光照诱导条件下的稳定内参基因，为分子机制研究提供基础。
研究流程
本研究主要包括以下几个步骤：
样本收集与培养
RNA提取与cDNA合成
样本经液氮研磨后，使用总RNA提取试剂盒提取RNA，并通过逆转录合成cDNA。
候选内参基因选择与引物设计
研究选择了10个候选内参基因，包括actin、cox5、tef1、ubi、18s、gpd、rpb1、try、tub1和tub2。这些基因覆盖了转录翻译、蛋白质合成与降解、细胞骨架结构和代谢等多个过程。引物设计采用NCBI Primer-BLAST工具完成。
RT-qPCR实验
使用LightCycler® 96系统进行RT-qPCR实验，检测每个样本中10个候选内参基因的表达水平。
数据分析
使用geNorm、NormFinder、BestKeeper和Comparative ΔCT四种方法分析候选内参基因的表达稳定性，并通过RefFinder综合排名确定最稳定的内参基因。
主要结果
1. 无性繁殖阶段
在无性繁殖阶段，最稳定的内参基因为tef1和tub1，其稳定性值（M值）分别为0.317和0.153。此外，tyr和tub2也表现出较高的稳定性。
子实体发育阶段
在子实体发育阶段，最稳定的内参基因为tyr和cox5，其稳定性值分别为0.689和0.619。这些基因在子实体形成和成熟过程中保持稳定表达。
光照诱导条件
在光照诱导条件下，最稳定的内参基因为tyr和tef1，其稳定性值分别为0.579和0.579。光照显著影响了O. sinensis的颜色和子囊形成，而这些基因在光照和黑暗处理下均表现出稳定的表达。
数据综合分析
综合四种分析方法的结果表明，不同实验条件下最稳定的内参基因有所不同。例如，在无性繁殖阶段，tef1和tub1最适合用作内参基因；而在子实体发育阶段，tyr和cox5更为稳定。这说明内参基因的选择应根据具体实验条件进行优化。
结论与意义
本研究首次全面筛选了适用于O. sinensis不同实验条件下的稳定内参基因，为研究其形态转化、子实体发育和光照响应的基因表达提供了可靠工具。研究发现，tef1和tub1适用于无性繁殖阶段，tyr和cox5适用于子实体发育阶段，而tyr和tef1适用于光照诱导条件。这些结果不仅有助于深入理解冬虫夏草形成的分子机制，还为人工培育技术的优化提供了理论支持。
研究亮点
1. 重要发现：首次系统筛选了O. sinensis不同发育阶段和光照条件下的稳定内参基因。
2. 方法创新：结合多种分析方法（geNorm、NormFinder、BestKeeper和Comparative ΔCT）并通过RefFinder综合排名，确保结果的可靠性。
3. 研究对象特殊性：针对冬虫夏草这一独特生物体系，填补了相关研究空白。
其他有价值内容
研究还发现光照显著影响了O. sinensis的颜色和子囊形成，为进一步探索其光响应机制提供了线索。此外，研究强调了内参基因选择的重要性，指出即使是常用基因（如18s和rpb1）也可能在特定条件下不稳定，需谨慎验证。