该研究是一项由Masataka Nishiga等人于2017年发表在《Circulation Research》期刊上的原创性研究。主要作者Masataka Nishiga及团队多数成员来自日本京都大学医学院心血管医学系，合作者还包括来自大阪红十字医院、关西医科大学、国家医疗机构京都医疗中心临床研究所、美国印第安纳大学医学院及神户市医疗中心综合医院的研究人员。研究发表于2017年3月3日。
本研究的学术背景聚焦于心血管疾病领域，具体针对心力衰竭（heart failure, HF）的病理机制，特别是心脏重塑（cardiac remodeling）过程中的纤维化（fibrosis）。尽管心衰治疗方案不断改进，它仍是全球主要死因，这提示需要深入理解其成因并开发创新治疗策略。心脏重塑涉及心肌细胞肥大、免疫细胞激活和纤维化等多个过程，被认为是一种炎症反应。研究指出，心衰与动脉粥样硬化（atherosclerosis）等疾病共享慢性炎症继发纤维化的核心机制。前期研究发现，一个高度保守的微小核糖核酸（microRNA, miRNA）——miR-33，因其在调节脂质代谢和炎症中的作用，被认为是动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。然而，miR-33在心力衰竭中的作用尚未阐明。因此，本研究的明确目标是阐明miR-33在心力衰竭中所扮演的角色。
研究的工作流程非常详尽，整合了临床样本分析、多种基因工程小鼠模型、体外细胞实验等多层次方法，以全面探究miR-33的功能。
第一项程序是临床样本相关性分析。 研究对象为33名被诊断为扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy）的患者。研究人员通过心内膜心肌活检获取了这些患者的左心室（left ventricle, LV）组织样本。实验方法上，他们使用TaqMan定量聚合酶链式反应（quantitative PCR, qPCR）测量了样本中miR-33a和miR-33b的表达水平，并通过心脏导管术（catheterization）获得了射血分数（ejection fraction, EF）、肺毛细血管楔压（pulmonary capillary wedge pressure, PCWP）等血流动力学参数。数据分析采用线性回归分析，探究了miRNA表达水平与心功能参数之间的关联，并根据Forrester分级将患者分为低阶段心衰（Forrester I）和高阶段心衰（Forrester III或IV）组进行比较。
第二项程序是利用全身性miR-33敲除（knockout, KO）小鼠模型进行体内功能研究。 研究使用之前报道过的miR-33 KO小鼠。实验对象是雄性C57BL/6J背景的小鼠，分为野生型（wild-type, WT）和miR-33 KO两组。对小鼠进行横向主动脉缩窄（transverse aortic constriction, TAC）手术，构建压力超负荷诱导的心脏重塑模型，并设立假手术组（sham）作为对照。实验包括多个时间点分析：在TAC术后2周，收集左心室组织，通过qPCR检测miR-33表达变化，并检测肥厚和纤维化相关基因（如Nppb, Col1a1, Postn, Tgfb3）的表达；在术后4周，进行组织学分析，包括小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin）染色评估心肌细胞横截面积，马松三色（Masson’s trichrome）染色和天狼星红（picrosirius red）染色评估心肌间质和血管周围纤维化面积。此外，在TAC术后长达8周的时间内，定期对小鼠进行超声心动图（echocardiography）检查，评估心脏结构和功能（如EF值、缩短分数、室壁厚度、心室直径），并应用斑点追踪应变成像（speckle-tracking strain imaging）测量更敏感的全局纵向应变（global longitudinal strain）。为了更全面地了解基因表达谱的变化，还对TAC术后2周的WT和KO小鼠心脏进行了微阵列（microarray）分析和基因本体（gene ontology）分析。TAC术后7天，通过腹腔注射溴脱氧尿苷（bromodeoxyuridine, BrdU）并结合免疫荧光染色（检测波形蛋白Vimentin和BrdU共染），在体评估心脏成纤维细胞的增殖情况。术后2周，还通过蛋白质印迹法（western blotting）分析了心脏组织中蛋白激酶B（Akt）和细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化水平。
第三项程序是体外细胞功能与机制研究。 为了明确miR-33作用的细胞类型，研究人员分离了新生大鼠的心肌细胞和心脏成纤维细胞，并通过qPCR比较了miR-33的表达水平。随后，他们从WT和miR-33 KO小鼠中分离了三种类型的成纤维细胞：小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）、成年小鼠心脏成纤维细胞和尾尖成纤维细胞。实验方法包括：MTT法绘制生长曲线以评估细胞增殖能力；流式细胞术（flow cytometry）结合膜联蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色，评估过氧化氢诱导的细胞凋亡；蛋白质印迹法检测血清刺激后Akt的磷酸化水平。为了探究潜在的分子机制，他们通过qPCR和蛋白质印迹法检测了miR-33已知靶基因ABCA1（ATP-binding cassette transporter A1）的表达变化。最关键的是，他们使用荧光标记的霍乱毒素B亚基（cholera toxin subunit b, CTB）——一种能结合细胞膜上脂筏标志物GM1神经节苷脂的探针，通过共聚焦显微镜成像和流式细胞术定量，分析了WT和KO成纤维细胞细胞膜上脂筏（lipid raft）的含量。此外，还使用小干扰RNA（siRNA）敲低ABCA1，并通过MTT法评估其对成纤维细胞增殖的影响，以验证ABCA1是否介导了miR-33的效应。
第四项程序是构建并验证心脏成纤维细胞特异性miR-33敲除小鼠模型。 为了排除全身性KO小鼠中高密度脂蛋白胆固醇升高和免疫细胞表型改变等全身性效应的干扰，研究团队创建了条件性敲除小鼠。他们首先通过同源重组技术构建了miR-33基因侧翼含有loxP位点的“floxed”小鼠。然后，将这种小鼠与在骨膜素（periostin, Pn）启动子驱动下表达Cre重组酶的转基因小鼠（Pn-Cre小鼠）杂交。Pn在正常成体心脏中不表达，但在压力超负荷等病理刺激下，会特异性地在心脏成纤维细胞中被诱导表达，因此能够实现成纤维细胞特异性的基因敲除。通过这种杂交，获得了心脏成纤维细胞特异性miR-33敲除小鼠（fbKO）。实验对象是fbKO小鼠及其同窝的floxed对照小鼠。对这些小鼠进行TAC手术，并在术后2周进行分析：qPCR检测心脏整体miR-33表达水平的变化；组织学染色（天狼星红）评估纤维化；免疫荧光染色（检测Ki-67和波形蛋白）量化增殖的成纤维细胞数量；同时检测血清高密度脂蛋白胆固醇水平以确认fbKO小鼠没有全身脂代谢改变。
研究获得了一系列重要且环环相扣的结果。
在临床样本分析中，结果显示，在扩张型心肌病患者中，心肌miR-33a（而非miR-33b）的表达水平与射血分数呈显著正相关，与肺毛细血管楔压呈显著负相关。更重要的是，高阶段心衰患者心肌中的miR-33a表达水平显著低于低阶段心衰患者，而其宿主基因SREBF2的表达则无差异。这一结果首次将miR-33a的表达下调与人类心衰严重程度联系起来，提示miR-33a可能在心功能维持中扮演保护性角色。
在全身性miR-33 KO小鼠的体内实验中，发现压力超负荷能显著上调WT小鼠心脏中的miR-33表达。组织学和基因表达分析表明，miR-33 KO小鼠与WT小鼠在TAC术后出现了同等程度的心肌细胞肥大，但心脏纤维化面积和纤维化相关基因（Col1a1, Postn, Tgfb3）的上调却显著减轻。基因芯片分析进一步证实，KO小鼠心脏中下调的基因富集在与纤维化和细胞外基质相关的生物学过程上。这些数据清晰地表明，miR-33缺陷特异性地减轻了压力超负荷诱导的心脏纤维化反应，而不影响心肌细胞的肥厚反应。然而，出乎意料的是，尽管纤维化减轻，长期的超声心动图随访（8周）显示，miR-33 KO小鼠的收缩功能（射血分数、缩短分数、全局纵向应变）比WT小鼠恶化得更严重，且室壁厚度的适应性增长在后期停滞。蛋白质印迹分析还发现，KO小鼠心脏中保护性的Akt信号通路激活减弱。这些体内结果看似矛盾（纤维化减轻但功能恶化），却与临床观察到的“低miR-33a对应更差的心功能”一致，暗示miR-33介导的纤维化可能具有适应性的保护作用，其缺失反而导致心脏对慢性压力适应不良。
体外细胞研究揭示了潜在的细胞机制。 首先，研究人员发现miR-33在心脏成纤维细胞中的表达水平显著高于心肌细胞，这解释了为什么miR-33缺失主要影响纤维化而非肥大。其次，三种来源的miR-33 KO成纤维细胞均表现出增殖能力受损和抗凋亡能力下降。血清刺激后，KO成纤维细胞中Akt的磷酸化激活也减弱。这些缺陷在体内得到了验证：TAC术后第7天，miR-33 KO小鼠心脏中掺入BrdU的增殖态成纤维细胞数量明显少于WT小鼠。机制探索方面，KO成纤维细胞中miR-33的靶基因ABCA1表达上调。更重要的是，CTB染色显示KO成纤维细胞细胞膜上的脂筏胆固醇含量显著降低。脂筏是质膜上富含胆固醇和鞘脂的微结构域，是多种信号通路（包括PI3K/Akt通路）的关键平台。因此，miR-33通过抑制ABCA1等基因，维持了成纤维细胞脂筏的胆固醇含量，从而保证了其正常的增殖和存活信号。使用siRNA敲低ABCA1可以逆转WT和KO成纤维细胞之间的增殖差异，进一步证实了ABCA1在此过程中的介导作用。
最后，心脏成纤维细胞特异性敲除小鼠（fbKO）的实验 成功复现了全身性KO小鼠的部分关键表型。fbKO小鼠在TAC术后，心脏miR-33表达上调幅度减小，心脏纤维化面积和增殖的成纤维细胞数量（Ki-67阳性）均显著低于对照小鼠，但心脏重量没有差异。重要的是，fbKO小鼠并未出现全身性KO小鼠那样的高密度脂蛋白胆固醇升高。这强有力地证明，心脏成纤维细胞自身表达的miR-33是驱动病理性心脏纤维化所必需的，而其促纤维化作用独立于全身性的脂代谢改变。
本研究的结论是：miR-33通过维持心脏成纤维细胞脂筏的胆固醇含量，调节其增殖能力，从而在压力超负荷诱导的心脏重塑过程中，驱动了一种适应性的纤维化反应，这种反应对于维持心脏的收缩功能具有保护作用。
这项研究的科学价值和应用意义重大。首先，它首次系统阐明了miR-33在心力衰竭，特别是心脏纤维化中的关键作用，将脂质代谢（胆固醇稳态）与心脏间质纤维化这两个重要病理过程联系起来，揭示了“脂质-纤维化轴”这一新的交叉机制。其次，研究提出了一个颠覆传统观念的观点：并非所有的心脏纤维化都是“坏”的；在压力超负荷的早期，由miR-33调控的、成纤维细胞介导的适度纤维化反应，可能是心脏维持结构和功能的一种必要适应性（或代偿性）保护机制。这加深了我们对心脏重塑复杂性的理解。第三，研究具有明确的转化医学意义。miR-33此前已被认为是治疗动脉粥样硬化的热门靶点。本研究揭示，长期或全面抑制miR-33可能对心脏功能产生有害的副作用，提示在将miR-33抑制剂推向临床应用治疗动脉粥样硬化时，必须审慎评估其对心脏的潜在影响，需要考虑组织特异性靶向或剂量方案，以避免损害心脏的适应性修复能力。这为精准治疗策略的开发提供了重要警示和理论依据。
本研究的亮点突出体现在：一、重要发现：明确了miR-33是调节心脏纤维化的关键分子，并创新性地提出其通过维持成纤维细胞脂筏胆固醇来驱动保护性纤维化反应的新机制。二、研究方法的系统性与创新性：研究设计非常完整，从人类疾病样本的相关性发现出发，利用全身性敲除、细胞特异性敲除、多种体外细胞模型等多层次遗传学工具进行因果验证和机制挖掘，逻辑链条严密。创建心脏成纤维细胞特异性miR-33敲除小鼠是本研究的关键技术亮点，有效排除了全身效应的干扰。三、研究对象的特殊性：聚焦于心脏成纤维细胞这一在心脏重塑中扮演双重角色的关键细胞，并成功解析了其功能的一个精细调控开关。
其他有价值的方面还包括：研究在讨论部分将本发现与其他器官（如肝脏）的纤维化研究相联系，指出miR-33可能是一种普适的促纤维化因子。同时，研究者也坦诚指出了研究的局限性，例如临床活检样本的异质性、缺乏来自成年小鼠或人的原代心肌细胞验证数据，以及Pn-Cre小鼠并非标记所有心脏成纤维细胞等，体现了科学的严谨性。这项研究是一项深入、系统且具有重要临床启示意义的优秀工作。