本研究的通讯作者是墨西哥伊拉普阿托市国立理工学院高级研究中心基因工程系的 Eugenio Mancera，主要合作者包括来自美国加州大学旧金山分校、加州大学默塞德分校、威斯康星大学麦迪逊分校，以及爱尔兰都柏林大学学院、科克大学学院等多个研究机构的科学家。该研究于2021年4月7日发表在开放获取期刊 eLife 上。

二、 研究的学术背景

本研究隶属于分子进化与真菌生物学交叉领域，旨在探究复杂转录调控网络在数百万年时间尺度上的演化模式和机制。研究的对象是控制念珠菌属（*Candida*）生物膜形成的一个复杂转录网络。该网络在白念珠菌（*C. albicans*）中已被详细描绘，包含七个核心转录调控因子（Bcr1, Brg1, Efg1, Flo8, Ndt80, Rob1, Tec1），它们彼此调控，并共同调控超过一千个靶基因，占其基因组基因总数的约六分之一。

研究动机源于几个关键的背景认知： 1. 念珠菌的临床重要性：念珠菌是人体微生物群的组成部分，也是重要的机会性病原体，其生物膜形成能力与定植、感染、尤其是与植入医疗装置相关的顽固性感染及抗真菌药物耐药性密切相关。 2. 复杂网络的起源：白念珠菌的生物膜调控网络虽复杂，但有证据表明其起源相对较晚。例如，在生物膜中高表达的基因富含“年轻”基因（即仅在亲缘关系较近的物种中存在直系同源基因）。 3. 调控因子的分化：先前对近平滑念珠菌（*C. parapsilosis*，与白念珠菌分化约7000万年）的研究发现，尽管六个核心调控因子存在直系同源基因，但只有两个是生物膜形成所必需的，表明网络组成可能发生了演化。

因此，本研究的目标是系统地阐明：控制生物膜形成的复杂转录网络在约7000万年的演化历程中是如何变化的？特别是，网络的核心组成（调控因子）和其连接关系（调控因子-靶基因结合）的演化速率和模式有何不同？

三、 详细的研究流程

研究流程设计严谨，涵盖了从表型比较到分子网络分析的多层次实验。

第一部分：跨物种生物膜表型比较 * 研究对象与规模：共分析了15种真菌，主要集中于CTG-Ser1进化枝，核心分析对象为白念珠菌及其三个常见于人体的近缘种：都柏林念珠菌（*C. dubliniensis*）、热带念珠菌（*C. tropicalis*）和近平滑念珠菌（*C. parapsilosis*）。还包括酿酒酵母（*S. cerevisiae*）和光滑念珠菌（*C. glabrata*）作为外群参考。 * 处理与实验： 1. 优化培养条件：在八种不同培养基中测试四种核心念珠菌的生物膜形成，最终确定蜘蛛培养基（以葡萄糖为碳源）是所有物种形成成熟生物膜的最佳条件。 2. 多种方法表征： * 生物量干重测定：在聚苯乙烯6孔板底部定量测量生物膜质量（5个技术重复）。 * 共聚焦扫描激光显微镜观察：在硅胶方块上培养生物膜，使用伴刀豆球蛋白A-Alexa Fluor 594染色，观察三维结构。 * 微流控装置实时监测：在模拟静脉导管流速的条件下，通过延时摄影观察生物膜形成动态。 3. 体内模型验证：使用大鼠中央静脉导管感染模型，对四种核心念珠菌进行24小时感染，通过扫描电子显微镜观察体内生物膜形成。 * 数据分析：根据生物量厚度和微观结构（酵母层、假菌丝、真菌丝的组成）评估生物膜复杂性，并与物种的系统发育距离相关联。

第二部分：核心调控因子的功能演化分析 * 研究对象：白念珠菌的七个核心调控因子（Bcr1, Brg1, Efg1, Flo8, Ndt80, Rob1, Tec1）在其他三种念珠菌中的直系同源基因。 * 处理与实验： 1. 基因敲除：在白念珠菌和近平滑念珠菌已有敲除库的基础上，使用营养缺陷型标记和SAT1筛选标记，通过融合PCR和电穿孔转化，在都柏林念珠菌和热带念珠菌中构建了这七个调控因子的基因敲除株（每个基因两个独立的敲除分离株）。 2. 表型评估：对敲除株进行生物量干重测定和共聚焦显微镜观察，判断其生物膜形成能力是否受损。 * 数据分析：统计每个物种中，白念珠菌的七个核心调控因子有多少个是其生物膜形成所必需的，并对比物种间差异。

第三部分：全基因组范围内调控因子-靶基因连接的演化分析（核心分子实验） * 研究对象：四种核心念珠菌中可成功进行染色质免疫沉淀测序的核心调控因子。 * 处理与实验： 1. 构建标记菌株：在四种物种的野生型背景中，使用质粒将每个核心调控因子的C端标记上MYC表位标签（13xMYC或6xMYC），并验证标记后生物膜形成能力正常。 2. 染色质免疫沉淀测序：在最佳培养基（蜘蛛+葡萄糖）中培养48小时生物膜，用甲醛交联，裂解细胞，使用抗MYC抗体进行免疫沉淀，纯化DNA后构建测序文库。 3. 严谨的对照与重复：使用无MYC标签的匹配菌株作为对照。每个调控因子在每种物种中进行两个独立的生物学重复实验。 4. 构建种间杂交体：敲除白念珠菌和都柏林念珠菌中NDT80-MYC标记菌株的MTL位点，使其能够发生交配，形成四倍体杂交体。在杂交体中分别对白念珠菌和都柏林念珠菌来源的NDT80进行ChIP-seq。此方法巧妙地将两个基因组置于同一细胞生理环境中，排除了物种间生理状态差异对结合谱的影响。 * 数据处理与分析： 1. 测序数据处理：使用Bowtie2将reads比对到各物种参考基因组，使用MACS2进行峰检测（peak calling），并取两个生物学重复的交集作为高置信度结合位点。 2. 靶基因鉴定：将结合峰分配给下游最近开放阅读框的启动子区。 3. 保守性分析：计算不同物种间调控因子靶基因集合的重叠比例。分析仅在所有物种中都存在直系同源基因的靶基因集合，以排除基因获得/丢失的影响。 4. DNA结合基序分析：使用DREME对每个调控因子的结合区域进行从头基序搜索。使用已知基序评估富集程度。 5. 网络结构分析：检查调控因子是否结合到其他调控因子的上游区域，以及靶基因是否被多个调控因子共同结合。

第四部分：生物膜特异性基因表达谱的演化 * 研究对象：白念珠菌、都柏林念珠菌和热带念珠菌。 * 处理与实验： 1. RNA提取：分别收集生物膜状态（48小时）和浮游生长状态（对数中期）的细胞。 2. 微阵列分析：使用物种特异性的定制安捷伦寡核苷酸微阵列进行全基因组转录谱分析。 * 数据分析：鉴定每个物种中在生物膜条件下差异表达的基因（通常以2倍变化为阈值）。计算不同物种间差异表达基因集合的重叠比例。将差异表达数据与ChIP-seq的靶基因数据进行关联分析。

四、 主要研究结果

1. 生物膜表型的演化呈梯度变化：

   • 生物膜形成的复杂性与系统发育距离密切相关。白念珠菌生物膜最厚、形成最快、最稳定。都柏林念珠菌和热带念珠菌的生物膜结构与之非常相似，均包含酵母基底层和主要由菌丝/假菌丝组成的上层。
   • 近平滑念珠菌生物膜较薄，上层主要由假菌丝构成。进化距离更远的物种（如*Lodderomyces elongisporus*）只能形成酵母细胞的薄层，更远的物种甚至不形成生物膜。
   • 大鼠导管模型证实了四种核心念珠菌都能形成体内生物膜，但白念珠菌和都柏林念珠菌的生物膜更厚、菌丝更丰富。
   • 结论一：形成复杂生物膜（类似白念珠菌）的能力仅限于其最密切相关的物种，表型复杂性随进化距离增加而降低。

2. 核心调控因子的组成发生缓慢替换：

   • 都柏林念珠菌中，白念珠菌的七个核心调控因子全部是生物膜形成所必需的。
   • 热带念珠菌中，七个里有五个是必需的，Rob1和Flo8变得可有可无，甚至可能具有微弱的抑制作用。
   • 近平滑念珠菌中，仅Bcr1和Efg1是必需的。此外，该物种还“招募”了其他在白念珠菌中不参与生物膜的调控因子（如CZF1, UME6）。
   • 结论二：调控网络的核心组成（即哪些转录因子扮演“主调控因子”角色）以相对缓慢的速度演化，其变化程度大致与物种间的进化距离平行。

3. 调控因子-靶基因的连接以极快速度重连：

   • 这是本研究最核心的发现。即使对于关系最近的白念珠菌和都柏林念珠菌（分化约2000万年），单个调控因子的靶基因保守性也很低。例如，Ndt80的靶基因重叠率约为50%，Efg1约为20%，Rob1甚至只有约12%。
   • 随着进化距离增大，重叠率进一步降低（如白念珠菌与近平滑念珠菌之间，Ndt80靶基因重叠率降至约26%）。
   • 尽管单个连接变化巨大，但某些调控因子的组合模式得以保留。例如，在所有四个物种中，超过75%的Efg1靶基因同时也是Ndt80的靶基因，且它们的DNA结合基序在彼此的结合位点中显著富集，表明Efg1-Ndt80的协同作用模式是古老的。
   • 网络的高连接性特征（即许多靶基因被多个调控因子共同调控）在所有物种中都得以保留。
   • 种间杂交体实验提供了决定性证据：在杂交体中，白念珠菌Ndt80主要结合白念珠菌基因组的靶点，而都柏林念珠菌Ndt80主要结合都柏林念珠菌基因组的靶点，两者的结合谱分别与各自物种中独立实验的结果高度相似。这强有力地证明，连接关系的巨大差异主要源于靶基因顺式调控元件（cis-regulatory elements） 的变化，而非调控因子自身（反式元件）结合特异性的改变或物种间生理状态的差异。
   • DNA结合基序分析支持上述结论：从头预测的各调控因子结合基序在四个物种间高度相似。用物种A的基序去预测物种B的潜在靶基因，其重叠度远高于实际ChIP-seq测得的靶基因重叠度，说明结合基序本身的微小差异不足以解释连接关系的巨大变化。

4. 生物膜特异性基因表达谱快速分化：

   • 不同物种在生物膜条件下的全基因组转录谱相关性随进化距离增加而降低。
   • 以2倍变化为阈值，白念珠菌与都柏林念珠菌之间只有29%的差异表达基因是共享的，与热带念珠菌之间只有24%共享。这与ChIP-seq显示的快速连接重连结果一致。
   • 分析表明，物种间基因表达差异与调控因子结合状态的差异（即某个基因在一个物种中被结合，在另一个物种中不被结合）显著相关，这进一步将表达差异归因于顺式调控序列的变化。

五、 研究结论与价值

本研究首次通过详实的实验数据，系统地描述了一个复杂转录调控网络在中等进化时间尺度（约7000万年）上的演化轨迹，并揭示了其演化的两个核心特征： 1. 核心元件的缓慢替换：网络的“主调控因子”组成以相对缓慢的速率发生替换。 2. 连接关系的快速重连：调控因子与其靶基因之间的连接关系以惊人的高速率发生变化，这主要是由靶基因顺式调控序列的改变驱动的。

科学价值： * 提供网络演化的实证模型：本研究为理解复杂调控网络的演化提供了第一个详细的经验性描述框架。 * 揭示演化速率的解耦：明确了网络不同组成部分（调控因子 vs. 调控连接）演化速率的巨大差异，挑战了网络整体缓慢演化的传统观念。 * 支持中性演化假说：研究者提出，鉴于表型（生物膜）相对保守而底层网络连接变化巨大，许多连接变化可能是中性演化（neutral evolution） 或 建构性中性演化（constructive neutral evolution） 的结果。网络可以在不显著破坏现有功能的前提下，快速探索新的连接配置，这可能为未来新表型的产生提供了演化素材。 * 方法学贡献：利用种间杂交体来精确区分顺式与反式变化的实验设计，为比较调控生物学研究提供了强有力的方法范例。

应用价值： * 理解念珠菌致病性分化：研究结果有助于解释为什么白念珠菌是临床上最主要的致病念珠菌（其生物膜网络最稳健、形成最快）。 * 识别关键靶点：跨物种保守的少数调控连接或靶基因，可能指向对生物膜形成至关重要的核心功能基因，为开发抗生物膜疗法提供新线索。 * 数据资源：本研究产生了大量的基因组规模数据（ChIP-seq和转录组数据），为后续研究念珠菌生物膜调控提供了宝贵资源。

六、 研究亮点

1. 研究问题的创新性：首次对一个复杂生物学表型的完整转录网络进行跨多个物种的演化追踪，填补了该领域的空白。
2. 多层次、系统性的实验设计：从表型到基因功能再到全基因组结合谱和表达谱，层层递进，逻辑严密。
3. 关键实验的巧妙设计：利用白念珠菌-都柏林念珠菌杂交体进行ChIP-seq，完美排除了生理状态差异的干扰，为“顺式变化主导”的结论提供了最直接的证据。
4. 重要且反直觉的发现：揭示了调控连接以远超预期的速度演化，而表型和网络核心架构却保持相对稳定，这一发现对理解基因调控与表型演化之间的关系具有重要意义。
5. 提出了一个可供检验的演化假说：即复杂转录网络可能通过快速的中性连接重连来探索新的配置空间，而主调控因子的替换和关键连接模式的保留则保证了核心功能的稳定。

七、 其他有价值内容

研究还讨论了白念珠菌临床分离株之间的变异，指出本研究使用的标准菌株SC5314代表了该物种形成厚生物膜的能力，而许多临床分离株可能因近期获得的突变（如EFG1失活）而生物膜形成能力减弱。这提示物种内的近期变异模式可能与物种间的长期演化模式不同。

这项研究是一项里程碑式的工作，它通过精湛的实验和深入的分析，为我们理解生命复杂性的演化机制提供了深刻的见解。