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本研究题为 “血管化类器官中实质细胞类型的程序性引入” 。通讯作者为加州大学圣地亚哥分校生物工程系的 Prashant Mali 教授，第一作者为 Amir Dailamy 和 Udit Parekh。该研究发表于 《Stem Cell Reports》 期刊，于 2021年10月12日 在线发表。
本研究属于组织工程和干细胞生物学交叉领域，旨在解决类器官技术发展的一个核心瓶颈。多能干细胞（PSC）衍生的类器官极大地推动了复杂人体三维组织的体外重建。然而，传统的定向分化方法主要专注于产生特定器官的实质细胞，难以在类器官中跨胚层引入其他必需的细胞类型，尤其是功能性血管网络。血管的缺失不仅限制了类器官在模拟发育和疾病中血管作用的研究价值，也因其无法为超过1毫米尺寸的组织提供养分和氧气，从而阻碍了构建大规模组织模型和再生医学应用。尽管已有一些血管化方法（如体内移植、ETV2过表达等），但它们或缺乏实验控制，或仅能产生有限的血管谱系（例如缺乏平滑肌细胞和周细胞）。因此，开发一种能在完全体外条件下、自下而上地构建包含完整血管网络和特定实质细胞的复合类器官平台，具有迫切需求。
研究团队提出了一种结合遗传重编程和化学定向分化的“自下而上”工程策略。其核心目标是：以一个已报道的、能够产生包含内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞等完整血管网络的血管类器官（VO）作为“支架”，通过在其中程序性过表达谱系特异性转录因子（TF），将神经元或骨骼肌细胞等实质细胞类型直接引入到正在发育的血管类器官中，从而构建出神经-血管和肌肉-血管等复合型类器官。这不仅是一个概念验证，更为从单一多能干细胞系完全体外衍生任何类型的血管化组织提供了路线图。
研究的具体工作流程和结果如下：
第一，构建并验证可诱导的细胞系。 为了实现对转录因子的精确时空控制，研究人员设计并构建了一个基于piggyBac转座子的四环素（Doxycycline， Dox）诱导型过表达载体系统。该系统可包装完整的Tet-On诱导系统以及一个或多个待过表达的转录因子和报告荧光蛋白。利用此平台，他们建立了三种稳定的人胚胎干细胞系：诱导型NeuroD1（iN，用于产生谷氨酸能兴奋性神经元）、诱导型Ascl1+Dlx2（iAD，用于产生GABA能抑制性神经元）以及诱导型MyoD1+Baf60c（iMB，用于骨骼肌分化）。通过添加Dox诱导后，qRT-PCR和免疫荧光分析证实iN和iAD细胞系均上调了神经元标志物（MAP2， TUBB3），且iN细胞特异性表达兴奋性标记vGLUT2，iAD细胞特异性表达抑制性标记vGAT。免疫荧光显示存在典型的MAP2阳性神经元形态。更重要的是，在共培养神经胶质细胞后，通过微电极阵列（MEA）记录到了iN和iAD神经元在培养3-5周后的自发性电活动，证明了其功能性。对于iMB细胞系，诱导后qRT-PCR证实了骨骼肌标志物（MYH8， TNNC1， RYR）的上调，免疫荧光显示存在纺锤形的MYH阳性及SAA阳性骨骼肌细胞形态以及MYOG阳性细胞核，验证了其分化为骨骼肌的能力。
第二，构建神经-血管和肌肉-血管类器官。 在获得可诱导细胞系后，研究人员开发了一个模块化、通用的实验流程。简单来说，将iN或iMB细胞聚集形成拟胚体（EB），随后依次使用中胚层诱导培养基（含BMP4和CHIR）和血管诱导培养基（含VEGF和Forskolin），并在整个过程中添加Dox以诱导神经或肌肉分化。在类器官形成第7天，将其包裹在基质胶和胶原蛋白混合基质中以促进三维成熟。最终成功构建了神经-血管类器官（iN-VO）和肌肉-血管类器官（iMB-VO）。对培养15天的iN-VO进行免疫荧光成像，显示仅在诱导组（+Dox）中出现了MAP2阳性的神经元束状结构，同时诱导组和未诱导组均形成了密集、相互交织的CDH5阳性血管网络，表明神经分化的特异性并未破坏预定的血管分化程序。全类器官扫描图像证实了内皮网络和神经元集群遍布类器官多个层面。qRT-PCR分析进一步显示，诱导的iN-VO中神经元标志物（MAP2， vGLUT2， BRN2， FOXG1）显著上调，而内皮标志物（CDH5， VEPTP）和平滑肌标志物（SMA）的表达水平与未诱导的血管类器官相当。同样，iMB-VO中可见MYH阳性的纺锤形骨骼肌细胞，并表达骨骼肌特异的基因（MYOG， MYH8等），证明了该平台同样适用于中胚层来源的组织构建。
第三，对神经-血管类器官进行长期培养和全面表征。 为了延长类器官的存活和功能维持时间，研究人员优化了培养条件，发现在血管成熟培养基中添加脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养因子-3（NT-3）可确保神经元的长期存活并维持血管谱系。在此基础上，他们对长期培养（直至45天）的iN-VO进行了深入的功能和组成分析。分子水平上，培养30天的iN-VO仍持续高表达神经元和血管标志物。免疫荧光成像证实了MAP2阳性神经元具有丰富的神经突生长，并与CDH5阳性血管网络长期共存。这些血管网络包含形成管腔的内皮细胞，且与PDGFRβ阳性的周细胞紧密相连，显示出成熟的血管结构。为了精确解析类器官的细胞组成，研究对培养45天的类器官（包括诱导15天、诱导45天和未诱导三种条件）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。通过对26,959个细胞的分析，发现所有类器官中都主要包含PRRX1阳性间充质祖细胞、MEOX2阳性分化周细胞和增殖细胞。重要的是，功能性的血管细胞类型——PDGFRβ阳性周细胞和PECAM1阳性内皮细胞，在所有类器官中均稳定存在（分别占细胞的16–22%和2.5–6%）。通过比对参考数据集，进一步确认了这些神经元与人类神经元的高度相似性。功能验证方面，体外实验显示类器官内的内皮细胞能够摄取乙酰化低密度脂蛋白，证实了其内皮功能。体内实验将培养30天的iN-VO皮下植入免疫缺陷小鼠，30天和90天后通过静脉注射德州红葡聚糖染料，发现染料与人类CDH5阳性血管及PDGFR阳性周细胞共定位，证明了这些人类来源的血管能够成功宿主化并与小鼠循环系统连接形成可灌注的功能性血管。此外，通过微电极阵列记录，研究人员在iN-VO中检测到了自发的电活动峰电位，而在未诱导的对照组中则没有，这直接证明了所生成的神经元在长期培养后仍具有电生理功能。
第四，体外电刺激促进肌肉-血管类器官成熟。 骨骼肌在体外的成熟是一个长期挑战。为了促进iMB-VO中骨骼肌的成熟，研究人员采用了慢性电刺激策略。他们将iMB-VO封装在纤维蛋白和基质胶的混合物中，并置于定制芯片的两个石墨电极之间，施加持续一周的恒定电压脉冲刺激。基因表达分析显示，与未刺激组相比，受刺激的类器官中胚胎型骨骼肌肌球蛋白（MYH3）表达显著上调，成年快肌肌球蛋白（MYH2）也有小幅增加。同时，钙处理相关基因（CASQ2， Serca2）也高度上调。这些结果表明，电刺激有效促进了iMB-VO向更成熟表型的转化，为在体外工程化构建大规模、成熟的血管化骨骼肌组织提供了一条潜在路径。
本研究得出结论，通过将谱系特异性转录因子的过表达与既定的血管类器官分化方案相结合，成功实现了在单一多能干细胞来源的类器官中跨胚层、跨谱系地共分化功能性实质细胞和完整血管网络。这不仅仅是一项技术展示，更是一个可扩展的平台性方法。
本研究的科学价值和应用价值在于：1. 方法论创新：提供了一种“自下而上”、完全体外构建血管化复合组织的通用工程蓝图，克服了传统定向分化的局限性。2. 模型价值：所构建的神经-血管和肌肉-血管类器官为研究神经血管单元、肌肉血管耦合、以及相关发育和疾病提供了更生理相关的体外模型。3. 再生医学潜力：证明了所构建的组织具有长期存活、血管可宿主化及神经/肌肉功能，为未来制造用于移植或药物测试的大规模工程化组织奠定了基础。4. 概念验证：成功验证了通过遗传重编程“定制化”引入特定实质细胞类型的可行性，为引入其他细胞类型（如肝细胞、胰岛细胞等）打开了大门。
本研究的亮点在于：1. 巧妙的整合策略：将遗传重编程（“基因指令”）与化学定向分化（“环境指令”）有机结合，创造性地利用血管类器官作为容纳其他细胞类型的“活体支架”。2. 完整的血管谱系：所生成的血管网络不仅包含内皮细胞，还包括对血管稳定和功能至关重要的周细胞和平滑肌细胞，这是许多现有血管化方法所欠缺的。3. 全面的功能验证：研究不仅停留在基因和蛋白表达层面，还通过电生理记录、体内移植灌注实验等，从分子、细胞到系统水平多层次地证明了所生成神经和血管组分的功能性。4. 长期培养与成熟方案：成功实现了神经-血管类器官长达45天的功能维持，并探索了通过生物物理刺激（电刺激）促进组织成熟的方法，提高了模型的实用性和复杂性。
其他有价值的内容还包括研究中对实验条件的细致优化（如确定使用100%的诱导细胞、优化长期培养的细胞因子添加），以及文中讨论部分对未来挑战的展望，例如需要发现更多细胞类型的重编程配方、改进空间组织的控制策略（如利用光遗传学或合成生物学）等，为领域后续发展指明了方向。