研究：人源多能干细胞来源内皮细胞修复脉络膜缺血
一、 作者、机构与发表信息
本研究的主要作者包括：Mengda Li, Peiliang Wang, Si Tong Huo, Hui Qiu, Chendi Li, Siyong Lin, Libin Guo, Yicong Ji, Yonglin Zhu, Jinyang Liu, Jianying Guo, Jie Na, 和 Yuntao Hu。这些作者来自多个机构，主要包括：清华大学北京清华长庚医院眼科中心、清华大学精准医学研究院、清华大学医学院、清华大学临床医学院、山西医科大学-清华大学前沿医学协同创新中心、清华大学复杂、重难罕见病国家重点实验室、清华大学干细胞与再生医学中心、清华大学生命学院以及北京大学第三医院妇产科生殖医学中心。本研究作为一篇研究文章，发表于 《Advanced Science》 期刊，于2023年12月19日在线发表，引用编号为：Adv. Sci. 2024, 11, 2302940。
二、 学术背景与研究目的
本研究的科学领域属于再生医学、干细胞疗法与眼科疾病治疗的交汇点。其核心背景是针对一种常见的眼底病理改变——脉络膜萎缩。脉络膜是眼球后部富含血管的组织，负责为外层视网膜（包括视网膜色素上皮层和光感受器细胞）提供主要的血液供应、营养和氧气。脉络膜萎缩与多种致盲性眼病的发生发展密切相关，如年龄相关性黄斑变性、病理性近视和视网膜色素变性。研究表明，在脉络膜萎缩过程中，构成脉络膜最内层血管网——脉络膜毛细血管的脉络膜内皮细胞是最早丢失的细胞。目前，对于以脉络膜缺血和萎缩为特征的疾病，尤其是“干性”年龄相关性黄斑变性，缺乏有效的治疗手段。
人源多能干细胞，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞，具有分化为体内几乎所有细胞类型的潜能。基于hPSC的细胞疗法已在眼科领域进行探索，例如hPSC来源的视网膜色素上皮细胞移植治疗AMD的临床试验已显示出安全性并可延缓疾病进展。然而，视网膜色素上皮细胞的健康高度依赖于其下方脉络膜的血供。因此，研究者提出假设：hPSC来源的内皮细胞可能具有修复损伤脉络膜血管、挽救脉络膜萎缩的潜力，从而为治疗相关眼底疾病提供新的策略。
本研究的主要目标包括： 1. 建立并验证一种能够模拟人类脉络膜萎缩病理特征的大鼠脉络膜缺血模型。 2. 利用先前建立的简化、高效、化学成分确定的诱导体系，从hPSC中分化出具有脉络膜内皮细胞特性的内皮细胞，并对其进行功能和分子标志物鉴定。 3. 在体外探索hPSC-EC与缺血脉络膜组织的相互作用，通过单细胞RNA测序分析hPSC-EC在缺血微环境中的基因表达变化。 4. 在大鼠脉络膜缺血模型中，通过脉络膜上腔移植hPSC-EC，评估其整合到宿主脉络膜血管、修复血管结构、增加脉络膜厚度、改善视网膜功能的治疗效果和安全性。
三、 详细研究流程
本研究包含一个逻辑严密的系统性工作流程，分为几个主要阶段，每个阶段包含具体的研究对象、处理方法和实验手段。
阶段一：hPSC向脉络膜样内皮细胞的定向分化与表征 * 研究对象与样本量：使用了多株hPSC系，包括H1、H9人类胚胎干细胞系，MESP1-mTomato报告基因干细胞系，H2B-mCherry干细胞系以及人诱导多能干细胞系。分化实验进行了多批次生物学重复（例如，qPCR n=3）。 * 处理与实验方法：采用了一种两阶段、单层培养、化学成分确定的诱导方案。第一阶段，使用BMP4和CHIR99021将hPSC高效诱导为MESP1+中胚层祖细胞（分化第3天）。第二阶段，使用VEGF-A和bFGF，将祖细胞进一步分化为内皮细胞（至第8天）。这种方法是基于团队先前建立和优化的体系。 * 实验内容： 1. 免疫荧光染色：检测分化第8天细胞表达的内皮细胞标志物，包括通用内皮标志物CD31、毛细血管标志物RGCC、脉络膜毛细血管特异性标志物CA4以及内皮细胞窗孔结构相关蛋白PV-1。结果表明这些标志物在细胞群体中均匀表达。 2. 定量PCR：动态监测分化过程中（第0、3、6、8天）上述标志物基因的表达变化，确认其表达量在分化后期显著上调。 3. 功能验证： * DiI-acLDL摄取实验：证明分化出的内皮细胞能够高效摄取乙酰化低密度脂蛋白，这是内皮细胞的典型生理功能。 * 体外管腔形成实验：将细胞接种在基质胶上，观察到其能够自发形成毛细血管样管状结构，证明其成血管潜能。 * 扫描电子显微镜：观察细胞表面形态，发现存在直径100-200纳米的孔状结构，模拟了体内脉络膜毛细血管内皮细胞特有的“窗孔”结构，进一步支持其与天然脉络膜内皮细胞的相似性。 * 数据与结果：该阶段成功获得了大量、高纯度的hPSC-EC。这些细胞不仅表达经典的内皮和脉络膜内皮标志物，而且具备成熟内皮细胞的代谢、成管功能以及关键的窗孔形态特征，表明其可以用于后续的移植研究。
阶段二：大鼠脉络膜缺血模型的建立与病理表征 * 研究对象与样本量：使用SPF级SD雄性大鼠。模型建立和后续表型分析涉及大量动物，例如，在厚度测量中n=119（来自6只动物的生物学重复），血管连接点密度分析中n=11（正常眼）和n=6（CI眼）。 * 模型建立方法：通过微创手术，将强氧化剂碘酸钠注射入大鼠右眼脉络膜上腔的颞侧象限，诱导局部脉络膜血管损伤和缺血。这是一种新颖的建模方法，旨在模拟原发性脉络膜血管损伤。 * 病理表征实验：在注射后不同时间点（7、14、30、90天）进行多模态评估。 1. 组织学染色：通过H&E染色观察眼球切片。结果显示，注射区域从脉络膜到视网膜外核层均出现组织结构破坏，脉络膜明显变薄（通过测量Bruch膜到巩膜的厚度并计算归一化脉络膜厚度量化），损伤可持续至少90天。视网膜内层血管基本完好。 2. 脉络膜铺片免疫荧光：摘取眼球，制作视网膜色素上皮/脉络膜复合体铺片，使用识别人和大鼠CD34的抗体进行染色。通过共聚焦显微镜分层观察。结果显示：缺血区域的视网膜色素上皮细胞萎缩、失去六边形形态；脉络膜毛细血管和中间血管层的血管网变得稀疏、萎缩；深层大血管层变化不显著。这明确了损伤主要发生在脉络膜毛细血管和中层血管。 3. 眼底血管造影：进行荧光素血管造影和吲哚菁绿血管造影。结果显示，缺血象限在ICGA上呈现为无血管化的暗区，证实了脉络膜毛细血管的萎缩。FA显示表层视网膜血管完好，表明损伤仅限于脉络膜血管。血管造影图像与干性AMD患者的眼底图像具有相似性，验证了模型的临床相关性。 4. 定量分析：使用AngioTool软件对血管造影图像进行分析，量化单位面积内的血管连接点密度。结果显示，从注射后第7天开始，血管密度显著降低并持续90天。 * 结果逻辑关系：成功建立的CI模型稳定再现了人类脉络膜萎缩的关键病理特征，为后续评估hPSC-EC的修复疗效提供了可靠的在体平台。
阶段三：hPSC-EC与缺血脉络膜的体外相互作用及单细胞转录组分析 * 研究对象：分离正常大鼠的脉络膜/巩膜复合体，与hPSC-EC进行共培养48小时。 * 实验方法： 1. 共培养与免疫染色：共培养后，清洗、固定组织，使用人特异性CD31抗体、人/大鼠CD34抗体及人细胞核抗体进行染色，确认hPSC-EC在离体缺血脉络膜上的附着与整合。定量分析显示，共培养组中约70%的细胞（DAPI+）是人CD31阳性细胞。 2. 单细胞RNA测序：收集共培养前后的hPSC-EC以及单独培养的离体大鼠脉络膜细胞，进行单细胞RNA测序分析。这是一个关键的分析手段，用于深入揭示细胞在微环境刺激下的分子响应。 * 数据分析与结果： 1. 细胞状态变化：UMAP降维分析显示，与缺血脉络膜共培养后的hPSC-EC在转录组水平上与分化后的初始EC明显分离，形成了独立的细胞群。 2. 基因功能富集：对差异表达基因进行GO分析。上调的基因功能涉及对低氧的反应、血管发育调节、细胞连接组装和细胞迁移等，提示移植的EC可能调节血管生成并促进损伤修复。下调的基因则与翻译、肌动蛋白相关过程和氧化能量代谢有关。 3. 关键基因表达： * 内皮命运增强：共培养后，hPSC-EC显著上调了经典内皮标志物PECAM1/CD31、CD34和CDH5。 * 促血管生成因子：分泌性促血管生成因子如VEGFA、HSPG2、EFNB2表达上调。 * 免疫调节因子：涉及免疫细胞迁移和募集的基因如ANXA1、ICAM1/2、ICOSLG，以及炎症相关的细胞因子/趋化因子如IL1A、IL16、CCL2、CXCL1表达上调。 * 神经保护/发育相关因子：低水平表达了多个参与神经发育和支持的基因，如SEMA6A、SEMA5A、SEMA3F、EFNB1、EFNB3等。特别是SEMA3F和GRN被报道与抑制异常脉络膜新生血管和神经退行性疾病保护相关。 4. 大鼠脉络膜内皮细胞状态：离体培养的大鼠脉络膜组织中，其内皮细胞的标志物如VWF、CD34、CDH5表达显著下调，提示在失去血供后可能发生了内皮-间质转化。 * 结果逻辑关系：此阶段证明，hPSC-EC在接触缺血脉络膜微环境后，不仅增强了其内皮特性，还上调了一系列与血管生成、免疫调节和神经保护相关的基因。这提示移植的EC不仅可能通过直接形成血管，还可能通过分泌有益因子来“重编程”局部的缺血/炎症微环境，从而发挥多重治疗作用。这为后续在体治疗效果的观察提供了分子机制上的线索。
阶段四：hPSC-EC在大鼠脉络膜缺血模型中的移植与修复效果评估 * 研究对象与分组：将大鼠随机分为三组：hPSC-EC移植组、假手术组（仅造模不移植）、培养基注射组（注射等量培养基）。在CI造模后第7天（此时血管萎缩已显著）进行细胞移植。 * 移植方法：通过相同的手术路径，将5×10^4个hPSC-EC（或培养基）注射到脉络膜上腔的缺血区域。 * 评估时间点与实验：在移植后7、14、30、60、90天进行评估。 1. 细胞存留与整合验证： * 流式细胞术：使用H2B-mCherry标记的EC进行移植，14天后分离脉络膜组织制备单细胞悬液进行流式分析，证实移植组中有约0.51%的mCherry阳性细胞存留。 * 免疫荧光染色：使用人特异性CD31和跨物种CD34抗体对脉络膜铺片和冰冻切片进行染色。结果显示，移植后长达90天，仍可检测到人CD31阳性细胞。高倍镜下可见这些细胞与宿主大鼠CD34阳性血管共定位，形成了管状结构，整合到了脉络膜毛细血管、中层和深层大血管等所有层面的血管网络中。定量分析显示，视野中约30-40%的细胞是人CD31阳性。 2. 脉络膜结构与功能修复评估： * FA/ICGA：EC移植组的眼睛，在缺血区域出现了新生的脉络膜血管，血管密度和长度随时间逐渐增加，至90天时仍可见。定量分析（AngioTool）证实，EC移植组的血管连接点密度在移植后14至90天显著高于非移植组和培养基组。重要的是，在所有血管造影图像中均未观察到血管渗漏或渗出性脉络膜新生血管。 * H&E染色与脉络膜厚度测量：EC移植组的脉络膜在损伤部位明显增厚。归一化脉络膜厚度在移植后30天恢复到正常水平，而非移植组和培养基组的脉络膜则持续显著变薄。 * 视网膜功能评估：移植后30天，使用视网膜电图评估视网膜功能。结果显示，CI模型大鼠的暗适应ERG（主要反映视杆细胞及其下游双极细胞功能）的a波和b波振幅显著降低。EC移植后，这些波形的振幅得到了显著改善，表明视网膜功能得到了部分恢复。 3. 安全性评估：作为对照，研究者还移植了等量的人脐带间充质干细胞。结果引发了严重的眼内炎症、玻璃体视网膜增生和血管结构紊乱。相比之下，hPSC-EC移植组在所有观察时间点均未检测到眼内炎症、出血或异常血管增生，表现出良好的安全性。 4. 额外发现：在非损伤区域的脉络膜上腔注射hPSC-EC，同样能观察到EC整合到正常脉络膜血管中并增加局部脉络膜厚度，表明这些细胞具有在脉络膜内迁移的能力。
四、 主要研究结果
本研究获得了一系列相互印证、层层递进的明确结果：
这些结果之间逻辑严密：分化获得的合格细胞是治疗的基础；稳定的动物模型是验证疗效的平台；体外分子机制探索为在体疗效提供了理论解释；最终，在体实验综合性地证明了细胞移植在结构、功能和安全性三个维度的全面治疗效果。
五、 结论与研究价值
本研究的结论是：人源多能干细胞来源的内皮细胞具有修复脉络膜缺血的潜力。 具体而言，这些细胞能够整合到损伤的脉络膜血管系统中，长期存活，促进血管新生和结构重建，增厚脉络膜，并改善由此导致的视网膜功能损伤，且安全性良好。
科学价值： 1. 概念验证：首次系统性地证明了hPSC-EC移植治疗脉络膜缺血性疾病的可行性，为修复脉络膜血管这一此前难以干预的病理环节提供了新的细胞治疗策略。 2. 机制揭示：通过单细胞测序，深入揭示了移植细胞在疾病微环境中的动态分子适应过程，包括其向内皮表型的巩固以及对血管生成、免疫、神经保护等多重通路的调控，超越了简单的“细胞替代”概念，提出了“微环境重编程”的潜在作用机制。 3. 模型贡献：建立了一种新型的、更贴近原发性脉络膜血管损伤的大鼠脉络膜缺血模型，为后续相关疾病的研究提供了有价值的工具。
应用价值/临床意义： 1. 新的治疗方向：针对目前无有效治疗的干性年龄相关性黄斑变性、病理性近视相关的脉络膜萎缩等疾病，hPSC-EC移植可能成为一种全新的治疗选择。 2. 联合治疗潜力：研究者在讨论中指出，鉴于视网膜色素上皮细胞的健康依赖于脉络膜血供，未来联合使用hPSC-EC与hPSC-RPE（或光感受器前体细胞）的“组合细胞疗法”，有望更全面地修复AMD中受损的“RPE-脉络膜-光感受器”功能单元，可能带来更佳的视力预后。 3. 临床转化优势：研究中使用的hPSC-EC分化体系简单、高效、成本可控，且细胞表现出低免疫原性，这些特性为其未来的临床转化奠定了良好的基础。
六、 研究亮点