在肌肉骨骼系统中，骨折愈合与异位骨化（heterotopic ossification, HO）是涉及多种细胞类型协同参与的复杂生物学过程。既往研究已发现，骨骼肌中驻留的纤维脂肪祖细胞（fibroadipogenic progenitors, FAPs）和骨膜浅层细胞在骨损伤后可获得成骨祖细胞特性，但这两类细胞在体内骨愈合中的生理意义及其分化调控机制一直缺乏明确阐述。这一空白主要受限于缺乏能够特异性标记并操控这些细胞群体的遗传工具。尤其值得注意的是，传统用于标记间充质谱系细胞的分子如PDGFRA和LY6A/SCA1因表达广泛，难以实现精准的谱系追踪。因此，寻找一种能够特异性标记FAPs及浅层骨膜细胞的新标志物，并据此构建谱系追踪模型，成为解析骨外细胞参与骨修复机制的关键切入点。
本研究由Ezgi Aydin、Jacob A. Moore与Ugur M. Ayturk等人完成，研究机构为美国纽约特种外科医院（Hospital for Special Surgery）骨骼健康与骨科研究项目及威尔康奈尔医学院骨科。论文发表于 *Bone Research*，2026年第14卷，文章编号70。
研究团队首先通过分析单细胞RNA测序数据，鉴定出*Clec3b*基因（编码分泌蛋白tetranectin）在PDGFRA⁺LY6A/SCA1⁺细胞中特异性高表达。基于此发现，研究团队利用CRISPR-Cas9技术构建了他莫昔芬诱导型*Clec3b^CreERT2*敲入小鼠模型，将T2A-iCreERT2构建体插入*Clec3b*基因编码区3′端，实现了对CLEC3B⁺细胞的不可逆荧光标记。这一遗传工具的建立使得研究者能够在体内精确追踪CLEC3B⁺细胞的命运及其在骨损伤后的分化轨迹。
在实验设计层面，研究涵盖了多个层次：首先通过单次或多次他莫昔芬注射对*Clec3b^CreERT2/+; R26^tdTomato/+*报告小鼠进行标记，观察CLEC3B⁺细胞在未损伤状态下的解剖分布及其与PDGFRA、SCA1等标志物的共定位；其次，利用稳定性和非稳定性股骨骨折模型、单皮质钻孔损伤模型以及BMP2诱导的异位骨化模型，追踪CLEC3B⁺细胞在病理条件下的动员与分化；再次，通过去除骨膜的钻孔手术、含或不含肌肉的股骨移植实验以及胫骨机械加载实验，区分肌肉FAPs与骨膜CLEC3B⁺细胞的相对贡献；此外，通过流式分选纯化tdTomato⁺细胞并进行单细胞RNA测序，解析CLEC3B⁺细胞在稳态与骨折愈合中的转录组异质性；最后，利用*Clec3b^CreERT2/+; R26^DTA/+*细胞消融模型和*Ctnnb1*条件性敲除模型，从功能上验证CLEC3B⁺细胞及WNT信号通路在骨形成中的必要性。
在P14或P21-P25他莫昔芬注射后，tdTomato⁺细胞主要分布于骨骼肌、结缔组织和浅层骨膜，而在骨髓腔、骨内膜、生长板及骨小梁表面完全缺失。免疫组化与流式细胞术分析证实，骨骼肌和骨膜中几乎所有tdTomato⁺细胞均共表达PDGFRA和SCA1。值得注意的是，单细胞RNA测序数据的回顾性分析显示，超过96%的PDGFRA⁺LY6A⁺FAPs表达*Clec3b*转录本，而RNAScope原位杂交验证了超过90%的*Pdgfra*⁺细胞同时为*Clec3b*⁺。这些结果表明，CLEC3B⁺细胞群体实质上代表了骨骼肌中的FAPs以及骨膜和结缔组织外层的PDGFRA⁺SCA1⁺细胞，且在生理性骨生长过程中保持成骨静默状态。
在稳定性股骨骨折模型中，tdTomato⁺细胞在骨折后6-10天主要聚集于纤维性骨痂，极少进入软骨性骨痂。至21天时，约28%的骨痂成骨细胞（BGLAP-eGFP⁺）来源于CLEC3B⁺谱系。至35天，tdTomato⁺细胞呈现网状形态并表达CXCL12-eGFP，表明其转化为骨髓基质细胞。关键的是，骨折后给予他莫昔芬不能标记骨痂内细胞，且qRT-PCR显示骨痂中纯化的tdTomato⁺细胞*Clec3b*表达显著下降，表明*Clec3b*表达在损伤后被迅速下调，CLEC3B⁺细胞通过去分化或谱系转换参与成骨。
通过去除骨膜后的钻孔损伤实验，研究团队发现即使无骨膜存在，CLEC3B⁺细胞仍能在3周后分化为成骨细胞和骨细胞，提示肌肉源性CLEC3B⁺细胞具有独立于骨膜的成骨能力。胫骨机械加载实验未检测到CLEC3B⁺细胞分化为骨细胞，排除了其在非损伤性成骨刺激下被激活的可能性。更为关键的是，原位移植实验显示，含肌肉的骨移植物在宿主骨缺损处形成的骨痂中tdTomato⁺细胞数量显著高于不含肌肉的移植物，定量分析确认两者差异具有统计学意义（p=0.016）。这些结果系统性地证明了骨骼肌驻留的CLEC3B⁺FAPs在骨折愈合中发挥主要作用，而浅层骨膜CLEC3B⁺细胞贡献有限。
对完整股骨及周围肌肉来源与骨折骨痂来源的tdTomato⁺细胞进行单细胞RNA测序后，经排除造血和内皮细胞污染，鉴定出5个转录组学上不同的细胞簇。簇#0、#1和#2表达高水平*Clec3b*，在完整和骨折标本中均存在，可通过“通用成纤维细胞”标志物COL15A1和PI16的表达差异进一步区分。簇#0高表达脂肪生成、肌生成和胶原基细胞外基质沉积相关基因；簇#1和#2富集TNFα和IL6-JAK-STAT炎症信号通路相关转录本。簇#3和#4仅存在于骨折骨痂中，分别代表骨髓基质细胞（表达*Lepr*、*Cxcl12*、*Adipoq*、*Kitl*）和成骨细胞（表达*Bglap*、*Ifitm5*、*Dmp1*）。所有簇中均未检测到有意义的增殖相关转录本表达，也未发现符合Chan等人定义的骨骼干细胞表达谱（CD200⁺CD105/ENG⁻或CD200⁻CD105/ENG⁻）。
在BMP2诱导的肌肉内异位骨化模型中，3周后形成的异位骨结节中大量tdTomato⁺细胞分化为成骨细胞和骨细胞，且大多数BGLAP-eGFP⁺成骨细胞来源于CLEC3B⁺谱系。在跟腱切断诱导的创伤性异位骨化模型中，tdTomato⁺细胞分化为软骨细胞、成骨细胞和骨细胞，证实CLEC3B⁺细胞参与结缔组织损伤后的异位骨化过程。
在*Clec3b^CreERT2/+; R26^DTA/+*小鼠中，骨折后持续他莫昔芬治疗使肌肉中CLEC3B⁺细胞减少65%，骨折骨痂的骨体积（BV）和骨体积分数（BV/TV）均显著降低（p<0.05），但骨痂总体积无变化。相似地，*Ctnnb1*条件性敲除（编码β-catenin）导致骨折骨痂骨体积分数显著下降（p<0.05）。在BMP2诱导的异位骨化模型中，BMP2注射前消融CLEC3B⁺细胞使肌肉Clec3b mRNA减少42%，异位肿块总体积显著减少（p<0.05）；*Ctnnb1*条件性敲除同样显著降低异位骨体积（p<0.05）。这些功能丧失实验表明，CLEC3B⁺细胞通过WNT/β-catenin信号通路依赖的方式促进生理性骨折愈合和病理性异位骨化。
在骨折后6天和10天的软骨性骨痂中，tdTomato⁺细胞占软骨面积的比例不足5%，10天时SOX9⁺软骨细胞中tdTomato⁺细胞不足10%。与之形成鲜明对比的是，BMP2注射后7天的异位软骨中约48%的SOX9⁺软骨细胞为tdTomato⁺。体外三维球培养进一步证实，纯化的CLEC3B⁺FAPs在TGFβ3和BMP6刺激下能够形成软骨。这些数据揭示CLEC3B⁺细胞在骨折修复中几乎不参与软骨形成，但在肌肉异位骨化中具有显著的软骨分化能力，表明其软骨分化潜能受到微环境信号的严格调控。
本研究通过构建新型*Clec3b^CreERT2*遗传工具，系统阐明了CLEC3B⁺细胞——主要为骨骼肌FAPs——在骨折愈合和异位骨化中的关键作用。与已知的骨膜骨骼祖细胞（如CTSK⁺、GLI1⁺、PDGFRA⁺、ACTA2/ASMA⁺细胞）不同，CLEC3B⁺细胞在骨折修复中表现出极低的软骨生成活性，但在异位骨化和体外培养条件下能够形成软骨，这一情境依赖性的分化行为为理解骨外细胞可塑性提供了重要线索。更为重要的是，功能丧失实验证实CLEC3B⁺细胞以WNT信号依赖的方式显著促进骨痂矿化和异位骨形成，提示靶向骨骼肌FAPs可能成为增强骨折愈合或抑制异位骨化的新型治疗策略。该研究将骨修复的细胞来源从传统的骨膜和骨髓基质扩展至骨骼肌间质，为创伤性肌肉骨骼损伤的治疗提供了新的细胞靶点和理论框架。