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毛细管电泳技术筛选高亲和力IgE核酸适配体的研究进展

作者及机构
本研究由明尼苏达大学化学系的Shaun D. Mendonsa和Michael T. Bowser*（通讯作者）合作完成，发表于《Analytical Chemistry》2004年9月15日第76卷第18期。

学术背景
该研究属于分子识别与生物分析化学交叉领域，聚焦于核酸适配体（aptamer）的体外筛选技术。传统SELEX（指数富集配体系统进化技术，Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）方法需通过8-12轮筛选才能获得高亲和力适配体，耗时长达4-6周，且存在固相载体非特异性结合、洗脱效率低等问题。研究团队提出了一种基于毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）的新型筛选方法（CE-SELEX），旨在解决传统技术的局限性，并显著提升筛选效率。

研究流程与方法
1. 文库设计与CE筛选
- 初始文库：构建含40个随机碱基的ssDNA文库（5′-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-(N40)-CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3′），总浓度2.5 mM。
- CE分离条件：采用聚乙烯醇涂层毛细管（50 μm内径），在pH 8.0的磷酸盐缓冲液中施加-20 kV电压，通过迁移速率差异分离与人类IgE结合的DNA序列。结合复合物因靶标IgE的等电点（pI≈9）导致迁移延迟，未结合DNA则快速洗脱。
- 低拷贝PCR优化：为解决CE进样量低（仅50 nL，含约1.5×10^6 IgE分子）的挑战，团队设计了高熔解温度引物（Tm=59.4°C），避免引物二聚体干扰，并通过18轮PCR扩增富集结合序列。

1. 多轮筛选与亲和力评估

   • 四轮CE-SELEX：每轮筛选后，通过亲和毛细管电泳（Affinity CE, ACE）测定池中DNA的平均解离常数（Kd）。第四轮后，随机挑选32个克隆测序，发现序列多样性高，未出现显著同源 motif。
     
   • “批量”Kd测定：采用荧光标记（6-FAM）的适配体与IgE结合实验，非线性拟合计算Kd。结果显示，四轮筛选后平均Kd为29±6 nM，表明文库中绝大多数序列具有均一的高亲和力。
     

2. 特异性验证

   • 针对6个随机选取的适配体，测试其对人类IgG和小鼠IgE的结合能力。结果显示，所有适配体对IgG和小鼠IgE的Kd均>20 μM，选择性比（人类IgE vs. IgG）超过700倍，证实了靶标特异性。
     

主要结果
1. 高效筛选：仅需2轮筛选即可使>90%的DNA池结合IgE，4轮后获得Kd低至29 nM的适配体，远快于传统SELEX的8-12轮。
2. 高亲和力与特异性：克隆测序显示适配体序列多样，但Kd分布集中（23-39 nM），且对非靶标蛋白无交叉反应。
3. 技术优势：CE的高分辨率避免了固相载体的非特异性吸附，且通过电泳迁移差异直接分离结合/非结合序列，提升了筛选纯度。

结论与价值
1. 科学意义：CE-SELEX通过物理分离原理（迁移速率差异）替代传统固相筛选，解决了洗脱动力学限制和载体干扰问题，为适配体筛选提供了新范式。
2. 应用潜力：该技术可加速适配体开发，适用于诊断（如IgE检测传感器）或治疗（靶向药物递送）领域。此外，其对小分子靶标的适用性仍需进一步验证。

研究亮点
- 方法创新：首次将CE与SELEX结合，将筛选周期从数周缩短至2-4天。
- 数据严谨性：通过“批量”Kd测量和克隆测序双重验证筛选效率与序列特性。
- 技术普适性：为其他蛋白靶标的适配体筛选提供了可推广的技术框架。

其他发现
研究还发现，CE-SELEX筛选出的适配体序列与早期IgE SELEX研究中报道的motif无重叠，提示同一靶标可能存在多种高亲和力结合模式，这一现象对理解核酸-蛋白相互作用机制具有启发意义。