本研究由来自蒙特利尔高等理工学院（École Polytechnique de Montréal）化学工程系、生物医学科学与技术研究组（Groupe de recherche en sciences et technologies biomédicales）及Bio-P2研究单元的Samantha Noel、Benoit Liberelle和Gregory De Crescenzo，以及加拿大国家研究委员会工业材料研究所（Industrial Materials Institute, National Research Council Canada）功能聚合物系统组的Lucie Robitaille共同完成。其中Samantha Noel与Benoit Liberelle为共同第一作者，Gregory De Crescenzo为通讯作者。该论文于2011年5月20日投稿，2011年6月15日修订，2011年7月7日在线发表于*Bioconjugate Chemistry*期刊第22卷第1690至1699页，DOI为10.1021/bc200259c。

在生物医学合成植入物的发展中，生物相容性材料需要具备特定功能并避免在宿主体内引发不良反应。由于生物反应发生在材料暴露于外部环境的表面，传统材料通常需要经过表面改性以获得新的特异性表面性质。在众多表面改性策略中，引入氨基（amino group）往往是有机聚合物表面功能化的第一步。氨基本身可以调节细胞黏附、组织相容性或亲水性，也可以作为化学反应位点进一步接枝生物活性分子，如寡糖、酶、肽、聚乙二醇（PEG）或葡聚糖等。然而，表面氨基密度直接影响后续功能化的效率和可控性，因此对其进行准确定量至关重要。现有的伯胺定量方法包括荧光法、比色法和光谱法，但多数方法要么成本较高，要么耗时较长，要么仅为半定量。阴离子染料比色法因其定量性、经济性和对不同几何形状材料的适用性而被广泛采用，但其可靠性可能受到染料在基底表面非特异性吸附的影响。此前，利用阴离子染料测得的伯胺含量往往缺乏系统性验证，也很少与后续接枝分子的数量建立明确的相关性。

本研究选取聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）作为模型基底。PET因其优异的物理、化学和机械性能而被广泛使用，但其疏水性和低黏附性导致生物相容性有限，因此是研究表面功能化的理想对象。研究团队通过两种不同的化学处理方式在PET薄膜表面引入伯胺基团：一种是利用乙二胺（ETDA）进行氨解反应，通过改变ETDA浓度（30%至40% v/v，以2%递增）产生不同范围的氨基密度；另一种是接枝25 kDa的聚乙烯胺（PVAM），以避免ETDA氨解过程中对PET基体造成的块体损伤。PVAM接枝分别在pH 4和pH 10条件下进行，以获得不同的氨基密度。

在氨基定量方面，研究比较了两种常用阴离子染料比色法：Orange II法和考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue, CBB）法，并以X射线光电子能谱（XPS）的表面原子组成作为参照。Orange II法基于酸性条件下带负电荷的磺酸染料与质子化氨基之间的可逆静电相互作用。氨基化薄膜在pH 3的Orange II溶液（14 mg/mL）中于40 °C孵育30分钟，经酸性溶液充分清洗去除未结合染料后，在pH 12碱性溶液中洗脱染料，调节pH至3后在484 nm处测定吸光度。CBB法使用0.5 mg/mL的CBB溶液（pH 2.2），在室温下浸泡5分钟，经酸性溶液清洗后，在pH 11.25的碱性溶液中洗脱染料，调整pH后在620 nm处测量吸光度。XPS分析用于表征PET薄膜的元素组成和化学键类型，包括全谱扫描及C 1s、N 1s和O 1s高分辨谱。所有样品在分析前均经过充分清洗和超声处理。XPS谱图以C 1s峰在284.7 eV处进行荷电校正，并使用Avantage v4.12软件进行定量分析。C 1s峰通过去卷积分析区分C—C、C—O和C═O等化学环境。在ETDA处理的PET表面上，C 1s谱中新增了归属于C—N键的峰，N 1s谱中识别出C—NH₂、O═C—N和C—NH₃⁺三种组分。对于PVAM处理的PET薄膜，C 1s谱中出现了C—N和C—C新峰，N 1s谱同样解析出三种氮化学环境。原子百分比数据显示，随ETDA浓度增加，C—N原子百分比上升而C—O原子百分比下降。除30% ETDA条件外，O═C—N与N的比值约为50%，表明每个ETDA分子中一个伯胺参与共价连接，另一个暴露于表面。PVAM处理薄膜的C—C含量低于ETDA处理薄膜，提示PVAM接枝层更厚。

Orange II法定量结果显示，原始PET表面的非特异性吸附极低（0.51 ± 0.04 pmol/mm²）。对于ETDA修饰薄膜，Orange II密度随ETDA浓度从30%至40% v/v增加而呈指数增长，范围约为6.0 ± 1.9至159.2 ± 24.8 pmol/mm²。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，在较高ETDA浓度下（尤其是40% v/v）PET表面粗糙度显著增加，这一现象可能解释指数增长趋势，因为比表面积增加导致染料可及区域扩大。PVAM接枝薄膜的Orange II密度分别为pH 10条件下的82.6 ± 2.4 pmol/mm²和pH 4条件下的5.1 ± 0.6 pmol/mm²。将Orange II密度与XPS得到的C—NH₂原子含量进行相关性分析时，对于ETDA浓度在0%至38% v/v范围内的样品获得了良好的线性相关（r² = 0.987，p < 0.001），验证了Orange II法用于伯胺定量的有效性。但40% v/v ETDA样品偏离线性关系，这被归因于极端表面粗糙度导致Orange II浓度被高估，而XPS分析深度固定（约50 Å）导致C—NH₂含量被低估。PVAM接枝薄膜的数据则位于ETDA线性相关趋势线下方，表明XPS检测到的部分PVAM内部氨基无法与染料相互作用，这很可能与聚合物在表面的构象有关。这一发现提示Orange II法可能更准确地预测后续化学功能化中真正可及的氨基数量。

CBB法与Orange II法的比较显示，原始PET表面CBB的非特异性吸附（1.62 ± 0.19 pmol/mm²）高于Orange II，且对于所有氨基化PET薄膜，CBB测定密度均低于Orange II。这一结果归因于CBB分子较大且为二价，存在较大的空间位阻，限制了其与部分氨基的结合。在Orange II密度低于50 pmol/mm²范围内，两种染料密度呈线性相关（r² = 0.896，p < 0.01），斜率为0.39，表明每分子CBB可能结合两个氨基，与Uchida等人提出的2:1化学计量比一致。因此，Orange II因其单一负电荷和较小空间位阻，在宽密度范围内提供了更可靠和特异的定量结果。

为了进一步验证Orange II法预测后续功能化可及氨基的能力，研究团队将一种异双功能连接子LC-SPDP接枝到ETDA和PVAM修饰的PET表面。LC-SPDP的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯基团在pH 7.4下与表面游离伯胺反应形成稳定酰胺键，而其吡啶二硫基团可与硫醇特异反应。与半胱氨酸（硫醇的最小含蛋白质单元）反应后释放的2-吡啶硫醇可在343 nm处定量，从而计算连接子接枝密度。LC-SPDP接枝条件优化实验表明，连接子浓度为1 mM时接枝密度达到平台；在40 °C下反应150分钟可获得最大表面覆盖（247 ± 15 pmol/mm²）。在50 °C下，吡啶二硫基团稳定性下降，导致接枝效率降低；在20 °C下反应速率较慢，受限于NHS酯基团在pH 7.4下的半衰期。将LC-SPDP接枝密度与Orange II密度进行相关性分析，发现所有ETDA和PVAM修饰薄膜均呈优异线性相关（r² = 0.986，p < 0.001），且斜率接近1（0.928）。这一结果明确证明，所有可被Orange II结合的氨基同样可被LC-SPDP接枝，即Orange II法可以定量预测后续生物功能化中实际可用的伯胺数量，且具有1:1的化学计量关系。

该研究的核心结论是，Orange II比色法是一种快速、简便、经济且可靠的方法，可用于定量PET表面接枝的伯胺基团密度并可预测其后续功能化潜力。其有效定量范围约为5至至少200 pmol/mm²。与CBB法和XPS相比，Orange II法特别适用于表征氨基酸基团中真正暴露于表面并可供后续化学修饰的活性位点。对于ETDA处理薄膜，XPS与Orange II结果的良好线性关系验证了该方法的定量性；对于PVAM处理薄膜，Orange II法则显示出比XPS更准确的“可及性”预测能力，因为XPS检测到的部分氨基深埋在聚合物层内，无法参与后续接枝反应。该研究的主要亮点在于：首次明确建立了染料吸附密度与后续共价接枝分子密度之间接近1:1的定量相关性，从而为Orange II法在生物材料表面功能化质量控制中的实际应用提供了坚实依据。此外，研究系统比较了两种常用染料和XPS方法在不同表面粗糙度及聚合物层构象条件下的表现，揭示了各种方法的适用范围和局限性，为生物材料表面氨基定量方法的选择提供了指导。