心脏结节病中炎症与自身免疫信号整合分子分析研究报告
一、 研究作者、机构与发表信息
本研究由来自多个国际知名研究机构的跨学科团队共同完成。主要作者包括Meraj Neyazi、Gabriela Venturini、Kemar J. Brown、Youjung Choi、Joshua M. Gorham、Olivia G. Layton、Arjun Verma、Adam J. Wang、Ryan T. Gross、Barbara A. McDonough、Michelle Mendiola Pla、Anissa Viveiros、Daniel M. DeLaughter、Steven R. DePalma、Yuri Kim、Daniel Reichart、Hiroko Wakimoto、Stephen J. Elledge、Sanjay Divakaran、Richard N. Mitchell、Jiwon Koh、Jun-Bean Park、Dawn E. Bowles、Carolyn Glass、Gavin Y. Oudit、Jonathan G. Seidman以及Christine E. Seidman。参与机构包括哈佛大学医学院布莱根妇女医院心血管部与遗传学系、德国汉堡大学医学中心、马萨诸塞州总医院、首尔国立大学医院、杜克大学、加拿大阿尔伯塔大学等。该研究于2026年6月23/30日发表在心血管领域顶级期刊《Circulation》上。
二、 学术背景与研究目的
心脏结节病（Cardiac Sarcoidosis， CS）是一种病因不明的炎症性疾病，其特征是心肌中出现散在的、无菌性肉芽肿，与保留的心肌组织和无肉芽肿的纤维化区域交织共存。CS可导致心律失常、心源性猝死和心力衰竭。尽管是结节病相关死亡的主要原因，但其独特的组织病理学模式（斑片状分布）和疾病进展的机制仍不清楚。现有免疫抑制疗法、心脏药物和抗心律失常装置疗效有限，无法阻止疾病进展。因此，深入解析CS不同病理区域（保留区、肉芽肿区、纤维化区）在细胞和分子水平上的异质性，对于揭示其发病机制、寻找新的治疗靶点至关重要。
本研究旨在利用前沿的单细胞和空间转录组学技术，结合B细胞受体测序和抗体筛选技术，系统性地描绘人类CS心脏的细胞图谱，并探究驱动其病理进展的关键分子通路和免疫反应。具体目标包括：1）比较CS三种不同组织病理区域（保留、肉芽肿、纤维化）的细胞组成和基因表达差异；2）识别参与肉芽肿形成和纤维化的关键细胞类型及其功能状态；3）探究CS心脏内是否存在克隆性扩增的B细胞及其产生的抗体；4）鉴定这些抗体所靶向的自身抗原，以揭示CS中潜在的自身免疫成分。
三、 详细研究流程与方法
本研究采用了多层次、整合性的分析策略，主要流程包括样本收集与处理、单细胞核RNA测序（snRNA-seq）与数据分析、空间转录组学分析、淋巴细胞受体序列分析与抗体重建、以及抗体特异性筛选。
1. 研究队列与样本处理： 研究纳入了22名CS患者的41份心室组织样本，取样部位包括左心室游离壁、室间隔、左心室心尖部和右心室游离壁。样本来源于心室辅助装置植入、心脏移植、肌切除术或尸检。所有CS诊断均由具有结节病专业知识的学术心血管病理学家根据组织病理学确认。根据主要组织病理学特征，将每个组织切片分类为以“保留心肌结构”、“肉芽肿（多核巨细胞突出）”、“纤维化（细胞减少，胶原丰富的细胞外基质突出）”为主的区域。从分类区域邻近的组织中分离细胞核进行snRNA-seq。作为对照，研究还整合了已发表的12名非衰竭供体心脏和29名扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy， DCM）心脏的snRNA-seq数据，使用相同的实验流程，最终数据集包含584，906个细胞核，其中CS细胞核185，893个。
2. 单细胞核RNA测序（snRNA-seq）与整合分析： 对CS、对照和DCM样本的细胞核进行snRNA-seq。使用Harmony算法整合所有数据，以校正批次效应。通过细胞类型特异性标记基因，鉴定出10种主要细胞类型：心肌细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、髓系细胞、神经元细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞、脂肪细胞和周细胞。随后，重点分析了不同组间以及CS内不同病理区域间细胞类型比例和转录状态的差异。特别关注了心肌细胞、成纤维细胞、髓系细胞和淋巴细胞的基因表达变化。
3. 空间转录组学分析： 为了将分子特征锚定在完整的组织空间结构中，研究对8个对照和10个CS（5个肉芽肿，5个纤维化）样本进行了空间转录组学分析（使用10x Genomics Xenium平台）。通过分析基因表达的空间模式，识别了不同的“细胞邻域”，例如心肌细胞富集邻域、免疫细胞富集邻域和成纤维细胞富集邻域，并进一步将免疫邻域细分为B细胞、T细胞和髓系细胞邻域。这揭示了CS组织中免疫微环境的精确空间组织。
4. 淋巴细胞受体序列分析与克隆性评估： 为了研究CS中的适应性免疫反应，研究团队使用TRUST4算法从snRNA-seq数据中提取B细胞和T细胞的V(D)J受体序列。通过分析互补决定区3（CDR3）序列来定义克隆型，并评估克隆大小（即属于同一克隆的细胞数量）。比较了CS与对照、DCM之间克隆性扩增的差异。此外，还重建了来自克隆性扩增B细胞的完整抗体序列。
5. 抗体特异性筛选（PhIP-seq）： 研究合成并表达了来自5名CS患者心脏中克隆性扩增B细胞的16种重组抗体。为了鉴定这些抗体识别的抗原，研究人员使用了噬菌体免疫沉淀测序（Phage Immunoprecipitation Sequencing， PhIP-seq）技术。将重组抗体与两个大型肽库进行孵育：一个涵盖人类蛋白质组的重叠肽段库（约60万条肽段），另一个包含来自微生物、过敏原的肽段库（超过12万条肽段）。通过高通量测序鉴定被抗体特异性结合的肽段，从而确定潜在的自身抗原靶标。对其中一个靶向Periplakin（PPL）的抗体（HV55-3）进行了免疫沉淀实验验证。
6. 统计分析： 生物信息学分析主要使用R语言和Seurat软件包。使用Wilcoxon秩和检验鉴定差异表达基因。使用EdgeR软件包进行伪批量数据的差异表达分析。使用超几何检验进行基因本体富集分析。使用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正。
四、 主要研究结果
1. CS不同病理区域具有独特的细胞组成和空间结构： snRNA-seq分析显示，CS心脏整体上心肌细胞比例显著减少（23.2% vs 对照47.7%），而成纤维细胞、淋巴细胞和髓系细胞比例显著增加。当按区域分层分析时，差异更为明显： * 保留区： 细胞组成与正常心肌相似，心肌细胞约占50%。 * 肉芽肿区： 心肌细胞急剧减少（10.9%），淋巴细胞极度富集（增加17倍，达28.1%），髓系细胞也显著增加（3.7倍）。 * 纤维化区： 心肌细胞同样减少（14.4%），成纤维细胞显著富集（27.0% vs 对照15.2%），淋巴细胞和髓系细胞比例高于对照但低于肉芽肿区。 空间转录组学进一步证实了这种异质性，并发现CS组织中存在独特的免疫细胞邻域，尤其是在纤维化区域形成了三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures， TLS），其中富含B细胞、T细胞和滤泡树突状细胞（通过免疫荧光染色CD20和CD23证实）。这些TLS在正常或DCM心脏中未观察到。
2. 心肌细胞和成纤维细胞的转录重编程驱动炎症和电生理紊乱： * 心肌细胞： 在所有CS区域，心肌细胞均表现出能量代谢（ATP产生相关基因下调）和蛋白泛素化（E3泛素连接酶基因上调）相关基因的失调。在肉芽肿和纤维化区域，心肌细胞下调了与自噬和心力衰竭相关的基因（如CSRP3），并显著上调了促炎基因（如IL1RAP, STAT1, GPR183, IL7）以及炎症小体和细胞焦亡（pyroptosis） 相关基因（如NLRC4, CASP4/5/8）。此外，心肌细胞还出现了致心律失常性基因表达改变，如钙调蛋白（CALM2）和桥粒蛋白（PERP）下调，钾通道（KCNC1）和缝隙连接蛋白（GJA9， GJB7）上调，这可能解释了CS患者高发心律失常的原因。 * 成纤维细胞： CS中促纤维化的成纤维细胞亚群（VFB2）扩张。重要的是，在肉芽肿区域的成纤维细胞（和脂肪细胞）特异性上调了趋化因子IL-16，这可能负责招募免疫细胞。此外，成纤维细胞高表达CCL19，这是一种已知能促进TLS形成的趋化因子，其受体CCR7在B细胞邻域中高表达，且CCR7表达水平与B细胞克隆最大大小显著相关，提示CCL19-CCR7信号通路在CS中驱动B细胞扩增和TLS形成中起关键作用。
3. 髓系细胞在肉芽肿形成中扮演核心角色： 研究发现了两种在CS中特异性富集的巨噬细胞状态： * MP_GPNMB状态： 表达M2样修复相关基因（如PPARG, GPNMB）。 * MP_GPNMB_CHI3L1状态： 除GPNMB外，还高表达CHI3L1（几丁质酶3样蛋白1， 又名GP39）、促炎细胞因子BAFF（B细胞激活因子），以及细胞融合关键调节因子DCSTAMP。空间转录组学和原位杂交证实，CHI3L1和GPNMB共表达的细胞正是形态学上的多核巨细胞，而仅表达GPNMB的为单核巨噬细胞。因此，MP_GPNMB_CHI3L1细胞代表了具有促炎和细胞融合能力的巨噬细胞，是肉芽肿的核心组成部分。
4. 淋巴细胞显示克隆性扩增并产生自身抗体： * T细胞： 在肉芽肿区富集了表达RORC的Th17样细胞，其中一种亚型（CD4_T_BAFF）还表达BAFF，可直接激活B细胞。 * B细胞： CS心脏中存在显著的B细胞多样性，包括过渡型B细胞、 naïve B细胞、生发中心样B细胞、年龄相关B细胞、浆细胞和静息记忆B细胞。与对照和DCM相比，CS（尤其是肉芽肿和纤维化区域）的B细胞表现出更显著、更大规模的克隆性扩增（最大克隆包含89个细胞），并伴有体细胞高频突变。在多名患者的多个心脏区域发现了相同的B细胞和T细胞克隆型，表明克隆在心脏内扩散。 * 自身抗体的发现： 通过合成来自克隆性扩增B细胞的16种重组抗体，并使用PhIP-seq筛选，研究发现11种抗体对34种不同的人类蛋白有高反应性，且不与微生物或过敏原肽段反应。这些靶蛋白中包括14种已知的自身抗原。其中一个代表性抗体（HV55-3， 来自一名患者左心室样本中6%的B细胞）特异性靶向Periplakin（PPL）——一种存在于皮肤、肺和心肌等组织的桥粒蛋白。免疫沉淀实验证实了HV55-3抗体能与天然的PPL蛋白结合。
五、 研究结论与意义
本研究通过高分辨率的单细胞和空间多组学分析，首次全面绘制了心脏结节病的细胞和分子图谱，并揭示了其进展的关键机制。研究得出结论：CS是一种空间组织化的疾病，其三种不同的组织区域（保留、肉芽肿、纤维化）由独特的细胞和分子程序驱动。进行性的炎症信号由保留心肌中的心肌细胞和成纤维细胞产生的趋化因子、肉芽肿区内表达细胞融合调节因子的活化巨噬细胞、以及纤维化区域中产生患者特异性自身抗体的三级淋巴结构共同介导。
科学价值与应用价值： 1. 机制突破： 首次在CS心脏中发现了克隆性扩增的B细胞、三级淋巴结构以及靶向心脏蛋白（如PPL）的自身抗体，确立了心脏内体液自身免疫轴在CS发病中的核心地位。这为解释CS与致心律失常性桥粒心肌病共享临床表型（如心律失常）提供了分子基础。 2. 治疗新靶点： 研究指出了多个潜在的精准治疗靶点，包括：靶向CHI3L1（已有在研人源化抗体）、靶向BAFF（如已上市药物Belimumab）、靶向B细胞（如抗CD20单抗利妥昔单抗，已有病例报告显示对难治性结节病有效）、以及靶向细胞焦亡通路（如已获批药物双硫仑）。靶向CCL19-CCR7轴或IL-16也可能干预免疫细胞招募和TLS形成。 3. 方法学创新与推广： 本研究建立的整合分析策略（snRNA-seq + 空间转录组 + V(D)J测序 + PhIP-seq抗体筛选）为研究其他病因不明的免疫介导性心脏病（乃至全身性自身免疫病）提供了范本，有助于发现新的自身抗原。 4. 疾病模型： 研究者提出了一个CS进展的工作模型：未知的起始刺激→心肌内髓系细胞浸润和巨噬细胞活化（形成肉芽肿）→Th17细胞和BAFF驱动B细胞活化→心肌细胞损伤和电生理紊乱→成纤维细胞活化及纤维化→形成TLS，B细胞克隆扩增并产生自身抗体（如抗PPL抗体）→自身抗体持续损伤，导致疾病进展和心力衰竭。该模型为后续机制研究和治疗开发提供了框架。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究还探讨了临床因素（如免疫抑制治疗、心室功能、室性心动过速）与组织病理或转录组变化的相关性，在本队列中未发现显著关联，但指出这可能是由于样本量小、治疗异质性等原因。此外，对9名患者样本的基因组测序排除了细菌、病毒或真菌感染序列，支持了非感染性、自身免疫性病因的假说。研究数据已公开共享，为领域内后续研究提供了宝贵资源。