2026年，由Huimin Zhong、Jiayan Zhou、Fujun Qin、Xian-en Zhang（张先恩）和Minghai Chen（陈明海）共同领导的研究团队，在《核酸研究》（*Nucleic Acids Research*）期刊上发表了一篇题为“可编程、靶标诱导的荧光CRISPR-Tdeg平台用于活细胞RNA可视化”的研究论文。该团队主要来自中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所、华中科技大学生命科学与技术学院、中国科学院生物物理研究所以及深圳大学先进技术学院。
此项研究属于RNA生物学与合成生物学交叉领域，旨在解决活细胞RNA实时可视化中长期存在的技术瓶颈。RNA分子在细胞功能调控、疾病发生及病原体感染中扮演核心角色，其丰度、定位和动态变化蕴含丰富的生物学信息。然而，现有的活细胞RNA成像技术，如MS2-MCP系统或荧光RNA适体，往往需要对目标RNA进行遗传工程改造（如插入重复的茎环结构），这可能干扰RNA的天然功能。基于CRISPR-dCas13的系统虽能实现序列特异性标记，但传统的dCas13与荧光蛋白直接融合的策略普遍存在高背景荧光的问题，这源于组成型表达的荧光蛋白信号或探针的非特异性结合，严重影响了成像的信噪比和特异性。
基于此背景，该研究的目标是开发一种无需修饰内源RNA、具有高信噪比和靶标诱导激活特性的活细胞RNA成像平台。其核心设计思路是将CRISPR-dCas13的靶向能力，与一种称为“Tdeg”的蛋白质稳定性调节机制相结合。Tdeg（Tat-degron）模块包含一个源自HIV的Tat短肽和一个降解决定子（degron）。当Tat肽与特定的RNA适体“Pepper”结合时，能保护与之融合的荧光蛋白免于被蛋白酶体降解，从而产生荧光；反之，未结合的荧光蛋白-Tdeg融合体会被迅速降解，将背景信号降至最低。研究团队将Pepper适体巧妙嵌入到引导RNA（crRNA）的支架中，设计出“环状Pepper-crRNA”。在未结合靶标RNA时，Pepper处于错误折叠的“关闭”状态，无法与Tat结合，荧光信号被抑制；只有当crRNA通过其靶向序列识别并结合到目标RNA上时，才会诱导Pepper适体正确折叠为“开启”状态，进而与dCas13-Tdeg复合物中的Tat肽结合，稳定荧光蛋白，产生强烈的靶标依赖性荧光信号。他们将这一系统命名为CTdeg（CRISPR–dCas13–Tdeg）。
研究流程系统而深入，大致可分为以下几个关键步骤：
第一步：CTdeg系统的设计与初步验证。 研究首先构建了CTdeg系统的核心组件：将优化的Tdeg模块（含Tat肽和降解决定子）与催化失活的Cas13蛋白（如dlwaCas13a）以及荧光报告蛋白（如采用split-GFP策略增强亮度的n*GFP）进行融合表达。同时，设计并合成了靶向不同内源RNA（如长非编码RNA NEAT1_1）的环状Pepper-crRNA。通过共转染HEK 293T细胞，初步验证了系统的可行性。为了严谨证明荧光激活严格依赖靶标RNA的存在，研究采用了多种对照：1）使用CRISPR-Cas9部分敲低NEAT1_1 RNA，观察到荧光信号相应减弱；2）在稳定表达SARS-CoV-2 N基因RNA的细胞系及其亲本细胞（无靶标）中进行测试，仅在表达靶标的细胞中检测到强烈荧光；3）比较了“失活”与“组成型激活”的Pepper-crRNA在无靶标细胞中的表现，确认了信号的靶标依赖性。这些结果共同证实CTdeg具有极低的背景活性和高度的靶标响应性。
第二步：系统优化以最大化信噪比。 在验证基本原理后，研究团队对Tdeg模块进行了系统的蛋白质工程改造，旨在进一步降低背景、增强靶标激活信号。他们设计了四个系列的Tat肽突变体（Y、I、G和Ĝ系列），主要涉及C末端氨基酸的替换（如引入源自Jembrana disease virus的“KIHY”基序）以及与不同降解决定子的融合方式。通过将不同Tdeg变体与靶向crRNA共表达，利用流式细胞术定量分析在有/无靶标情况下细胞的荧光强度，计算“激活比”（靶标诱导信号/背景信号）。从数十个变体中筛选出了性能最优的变体G3。与原始Tdeg相比，G3变体将系统的激活比从约4倍显著提升至约9倍，在共聚焦成像中也显示出更高的对比度和更干净的背景。此项优化工作是本研究的一个重要创新点。
第三步：结构建模与机理支撑。 为了从结构层面理解靶标诱导激活的机制，研究利用AlphaFold3对环状Pepper-crRNA在结合靶标前后的构象进行了预测建模。结果显示，靶标结合可能诱导Pepper适体发生构象重排。此外，使用HADDOCK 2.4进行了Tdeg模块与Pepper-crRNA之间的分子对接模拟。对接分析预测了二者之间合理的相互作用界面，能量参数符合典型的RNA-蛋白质相互作用特征，为实验观察到的靶标依赖性结合与稳定化提供了结构生物学的支持。
第四步：应用于内源RNA的特异性成像。 研究将优化后的CTdeg（G3变体）系统应用于更具挑战性的内源RNA成像。首先靶向核内RNA NEAT1_2（Paraspeckle核体的支架RNA）。通过给dCas13融合蛋白添加核定位信号，CTdeg成功在细胞核内形成了与Paraspeckle标志蛋白Nono共定位的荧光斑点。更重要的是，他们通过RNA荧光原位杂交直接证实，这些CTdeg信号斑点内确实含有内源的NEAT1_2 RNA，而非仅仅是定位到相关的蛋白质结构上，从而确凿证明了其标记的特异性。此外，研究还展示了CTdeg能够对表达量较低的内源mRNA（如FOS和MYC）进行成像，其荧光信号强度与靶标RNA的表达水平相关，证明了系统具有一定的灵敏度。
第五步：系统通用性与生物相容性评估。 为了证明CTdeg平台的通用性，研究将其与多种Cas13直系同源物（dLwaCas13a, dPspCas13b, dRfxCas13d）和荧光报告蛋白（n*GFP, Venus, mCherry）进行组合测试。结果表明，该系统在不同组合下均能实现靶标依赖性的荧光激活，展现了良好的模块化特性。同时，研究通过CCK-8细胞活力检测、凋亡分析和内源RNA稳定性监测等一系列实验，证实了CTdeg系统的表达对细胞活性、凋亡以及目标RNA（如MYC）的天然降解动力学没有产生显著扰动，具有良好的生物相容性。
第六步：与现有技术的性能比较。 研究将CTdeg与两种主流RNA成像技术进行了直接比较：1）传统的dCas13-荧光蛋白融合系统；2）近期报道的CRISPR-CSM（用于单分子成像的多crRNA阵列）系统。结果表明，在成像信噪比方面，CTdeg显著优于传统的dCas13-FP方法。在与CRISPR-CSM比较时，CTdeg在仅使用单个crRNA的情况下，其背景荧光水平低于使用多crRNA阵列的CRISPR-CSM系统，并且达到了可比的甚至更高的信噪比，突显了其在简化设计和高对比度成像方面的优势。
第七步：动态过程可视化应用。 最后，研究利用CTdeg低背景、高特异性的优势，展示了其在活细胞中实时追踪RNA动态过程的强大能力。他们建立了一个稳定表达CTdeg系统的Vero E6细胞系，并进行了两个精彩的应用示范： 1. 核内Paraspeckle动态：以1分钟为间隔进行延时成像，首次实时捕捉到了NEAT1_2 RNA参与的Paraspeckle核体之间复杂的“亲吻-融合-分裂”动态事件，并对其运动轨迹和速度进行了量化分析。 2. SARS-CoV-2基因组RNA运输：在病毒感染早期，利用CTdeg系统与染料预标记的病毒颗粒进行双色成像，成功可视化并追踪了SARS-CoV-2基因组RNA进入细胞后的胞内运输轨迹，揭示了其既有随机运动也有定向运动的模式。 此外，研究还观察到SARS-CoV-2感染会诱导宿主细胞NEAT1_2 RNA的积累和Paraspeckle动态变化，为病毒-宿主相互作用提供了新的成像证据。
本研究的结论是，团队成功开发了一种全新的、可编程的活细胞RNA成像平台——CTdeg。该系统通过将靶标RNA识别与Tdeg介导的荧光蛋白条件性稳定化机制相偶联，实现了对未修饰内源RNA的高特异性、低背景可视化。其核心价值在于：科学价值上，它为解决活细胞RNA成像的高背景难题提供了一种创新且有效的方案，其“靶标诱导激活”的设计理念和优化的Tdeg模块具有方法论上的创新性；应用价值上，CTdeg平台兼具高特异性、低扰动性、模块化（兼容多种Cas13和荧光蛋白）和操作简便性（单crRNA即可工作），使其成为研究RNA定位、运输、动态组装（如相分离）、以及病毒-宿主RNA相互作用的强大工具，在基础RNA生物学、病毒学和合成生物学领域具有广泛的应用前景。
此项研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先，方法学的创新性：创造性地将Pepper适体嵌入crRNA支架，并系统性地优化了C端Tdeg模块，实现了荧光信号的严格靶标控制与极低背景，这是对现有CRISPR RNA成像技术的重要革新。其次，应用的突破性：不仅实现了对多种类型RNA（核内lncRNA、胞质mRNA、大型病毒基因组RNA）的静态成像，更成功应用于秒/分钟尺度的动态过程记录，如Paraspeckle的瞬时互作和病毒RNA的早期运输，提供了前所未有的时空分辨率信息。最后，严谨的验证体系：研究通过基因敲低、正交的RNA-FISH验证、严格的阴性/阳性对照、以及与金标准方法（MS2-MCP）的对比，全方位地证明了CTdeg系统的特异性、准确性和可靠性。
这项研究报道的CTdeg平台代表了活细胞RNA成像技术的一个重要进展。它不仅为RNA生物学研究提供了利器，其模块化设计和条件稳定性控制策略也为开发其他类型的生物传感与调控工具提供了新的思路。