本研究由隶属于日本国立先进工业科学技术研究所（AIST）纳米材料研究所的Shogo Kanoh、Atsushi Hirano（通讯作者）及其同事，联合筑波大学、NGK火花塞-AIST医疗材料合作研究实验室的研究人员共同完成。研究成果以题为《色谱法纯化组氨酸标签蛋白：使用磷酸基团修饰的氧化锆颗粒》的学术论文形式，于2023年5月27日在线发表于《Journal of Chromatography A》期刊第1703卷。该研究针对现有组氨酸标签（His-tag）蛋白纯化技术的缺陷，提出并验证了一种基于磷酸化氧化锆颗粒的新型层析纯化方法。
学术背景与研究目的
在分子生物学和生物技术领域，重组蛋白的纯化是关键步骤。固定化金属离子亲和层析（Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC）是目前最常用的纯化组氨酸标签蛋白的技术。其原理是利用蛋白质N端或C端的组氨酸标签（通常为六组氨酸，His6）与层析柱填料上固定的过渡金属离子（如Ni2+、Co2+、Cu2+）之间的配位键进行特异性吸附。IMAC虽然能实现高纯度纯化，但其洗脱过程通常需要使用低pH缓冲液或高浓度咪唑溶液。这些洗脱条件可能导致蛋白质构象改变、活性丧失或功能抑制。此外，洗脱过程中可能伴随金属离子泄漏，这些金属离子不仅影响纯化收率，其中一些（如Ni2+、Co2+）还具有潜在致癌性。而洗脱后残留的咪唑也可能干扰后续分析（如核磁共振谱）或影响酶活性。
离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography, IEX）也常用于His标签蛋白的纯化，主要基于蛋白质与填料上带电配体之间的静电相互作用。IEX可使用常规盐溶液进行洗脱，避免了IMAC的上述问题，但其选择性通常低于IMAC，因此较少作为一步纯化His标签蛋白的首选方法，而多作为IMAC的上游或下游辅助步骤。
本研究旨在开发一种能够克服IMAC缺点的新型His标签蛋白纯化方法。研究团队将目光投向了一种经过磷酸基团修饰的氧化锆颗粒。此前的研究表明，磷酸化氧化锆颗粒可作为阳离子交换剂用于蛋白质纯化，特别是对免疫球蛋白具有高选择性吸附能力，且这种吸附可在中性pH下通过调节盐浓度来控制，有利于保持蛋白质活性。其吸附机制被认为与蛋白质中碱性氨基酸残基（组氨酸、赖氨酸、精氨酸）和颗粒表面磷酸基团之间的静电相互作用有关。尤为关键的是，有研究发现磷酸化氧化锆颗粒对寡聚组氨酸等碱性多肽有强吸附作用，且吸附强度随多肽长度增加而增强。基于此，研究团队提出假设：磷酸化氧化锆颗粒对寡聚组氨酸的吸附能力可应用于His标签蛋白的纯化。具体而言，His标签蛋白可在中性pH下吸附于该材料，并通过高浓度盐溶液洗脱，从而实现无需低pH、螯合剂、咪唑或重金属离子的温和、高效纯化。本研究的核心目标即是验证这一假设，系统评估磷酸化氧化锆颗粒对His6及其标签蛋白的吸附与纯化性能，并与传统阳离子交换填料及常规IMAC填料进行对比。
详细研究流程
本研究包含以下主要流程：
磷酸化氧化锆颗粒的制备与表征：首先，研究团队采用喷雾干燥工艺，以商业氧化锆纳米颗粒为原料，制备了球形氧化锆二次颗粒。随后，使用乙二胺四亚甲基膦酸对该颗粒进行表面修饰，使其接枝磷酸基团，得到磷酸化氧化锆颗粒。接下来，对材料进行了系统的物理化学表征，包括：广角粉末X射线衍射分析确认其晶体结构为单斜晶系；傅里叶变换红外光谱证实磷酸基团的存在；热重分析估算磷酸配体含量约为0.3 wt%；场发射扫描电镜和透射电镜观察颗粒形貌（球形二次颗粒直径约77.7±10.6 μm，一次颗粒为纳米级）；以及氮气吸附-脱附等温线测定其比表面积、孔体积和孔径分布。这些表征确保了材料的结构与预期一致，并为其后的吸附性能研究提供了基础物性数据。
His6吸附能力的初步评估：为了验证核心假设，研究首先以His6作为His标签的模型分子，评估了磷酸化氧化锆颗粒对其的吸附能力。采用批量吸附法，在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，比较了磷酸化氧化锆颗粒与两种传统阳离子交换剂（弱阳离子交换剂CM Sepharose和强阳离子交换剂SP Sepharose）在不同氯化钠浓度下对1 mM His6的吸附量。同时，使用填充有这三种填料的层析柱，通过线性梯度或阶跃梯度洗脱的方式，考察了His6在柱上的保留与洗脱行为，洗脱剂分别为含NaCl的缓冲液或不同浓度的磷酸盐缓冲液。实验还测试了高流速（10 mL/min）下His6在磷酸化氧化锆柱上的层析表现。
His标签蛋白的吸附与解吸验证：选择带有C端His标签的绿色荧光蛋白作为第一个模型蛋白，通过直观的荧光观察和柱层析实验验证磷酸化氧化锆对实际His标签蛋白的结合能力。批量实验中，将含有GFP-His的裂解液与不同填料混合，离心后在254 nm紫外光下观察绿色荧光分布，直观判断蛋白在填料上吸附还是在溶液中。柱层析实验中，将GFP-His裂解液上样至磷酸化氧化锆柱及对照的阳离子交换柱，用阶跃提高浓度的磷酸盐缓冲液洗脱，同时监测280 nm（总蛋白）和460 nm（GFP特征吸收）的紫外吸收，分析GFP-His的洗脱峰位置及与杂质的分离情况。
His标签蛋白的纯化性能评估与对比：这是研究的核心应用验证环节。使用填充好的磷酸化氧化锆柱和作为对照的Ni-NTA柱，分别对两种模型蛋白进行纯化：GFP-His和与麦芽糖结合蛋白融合的His标签碱性磷酸酶。对于GFP-His，采用与验证实验相似的阶跃洗脱程序。对于MBP-PhoA-His，由于初步纯化效果不佳，优化了流程：首先将样品溶解并上样于77 mM磷酸盐缓冲液平衡的柱子，然后依次用380 mM和770 mM磷酸盐缓冲液洗脱。所有纯化洗脱组分收集后，通过超滤离心进行浓缩脱盐，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，通过考马斯亮蓝染色条带的强度评估纯化产物的纯度和收率，并与Ni-NTA柱的纯化结果进行系统比较。此外，研究还考察了磷酸化氧化锆柱在多次重复使用（无需特殊再生处理）下的纯化稳定性。
主要研究结果
材料表征结果：成功制备了表面接枝磷酸基团的球形氧化锆颗粒。XRD证实其为单斜晶相，FT-IR谱图中1000-1200 cm-1和400-800 cm-1范围内的吸收峰分别归属于磷酸基团和氧化锆的特征振动，TGA曲线在250°C以上的重量损失证实了有机磷酸配体的存在并估算其含量。SEM显示颗粒球形度好，TEM显示其由纳米级一次粒子构成，BET分析表明材料具有多孔结构，有利于蛋白质传质。
His6吸附能力显著优于传统阳离子交换剂：批量吸附实验显示，在无NaCl时，三种材料对His6的吸附量相近（约80%）。但随着NaCl浓度增加，磷酸化氧化锆颗粒的吸附量下降最慢，在100-1000 mM NaCl范围内，其吸附量显著高于CM Sepharose和SP Sepharose，表明其对His6具有更强的结合能力和更高的盐耐受性。柱层析结果与此一致：在线性梯度洗脱中，His6从磷酸化氧化锆柱上洗脱所需的NaCl浓度（约980 mM）远高于从CM柱（约510 mM）和SP柱（约530 mM）。使用磷酸盐缓冲液进行阶跃洗脱时，磷酸化氧化锆柱能将His6有效保留在4 mM和23 mM条件下，并在380 mM时将其集中洗脱，峰形尖锐。即使在10 mL/min的高流速下，His6的保留与洗脱行为也未受显著影响，仅观察到轻微的峰展宽，证明了氧化锆颗粒优异的机械强度和高压耐受性，适合快速纯化。
对GFP-His具有高选择性吸附：批量荧光实验直观显示，在4 mM磷酸盐缓冲液中，GFP-His被磷酸化氧化锆颗粒特异性吸附（荧光集中在填料沉淀中），而溶液中几乎无荧光；当缓冲液浓度升至380 mM时，GFP-His被完全解吸（荧光均匀分布在溶液中）。相反，在CM和SP Sepharose存在下，GFP-His主要存在于溶液中，表明这些传统填料在实验条件下对GFP-His的吸附很弱。柱层析结果进一步证实：在磷酸化氧化锆柱上，GFP-His（460 nm信号）主要在380 mM磷酸盐缓冲液洗脱时出峰，而大部分杂质蛋白（280 nm信号）在4 mM时即被洗脱，实现了良好分离。而在CM和SP Sepharose柱上，GFP-His与杂质均在低盐条件下共洗脱，无法分离。这清晰地证明了磷酸化氧化锆柱对His标签蛋白的高结合能力和高选择性。
纯化性能与IMAC相当，且条件温和：对GFP-His的纯化显示，磷酸化氧化锆柱可获得高纯度产物，SDS-PAGE显示约28 kDa处有明显的目标条带，杂质很少。其纯度与Ni-NTA柱纯化结果相当，收率略低但相近。对更大、更复杂的MBP-PhoA-His（约93.4 kDa），优化后的纯化流程（初始缓冲液为77 mM）也获得了与Ni-NTA柱相当的纯度，SDS-PAGE中93 kDa处目标条带清晰。两条纯化流程中观察到的少量共洗脱杂质条带（约40 kDa）在两种柱子上均出现，推测是裂解液中本身存在的富含组氨酸或高碱性蛋白。这表明磷酸化氧化锆柱对His标签蛋白的识别特异性与IMAC有相似之处。值得注意的是，磷酸化氧化锆柱的纯化收率对于大分子量蛋白（MBP-PhoA-His）低于Ni-NTA柱，作者分析这可能与蛋白尺寸增大导致的位阻效应或结合概率降低有关，并建议可通过增大柱体积来提高结合容量以改善收率。最关键的是，整个纯化过程仅使用了不同浓度的磷酸盐缓冲液（pH 7.0），完全避免了低pH、螯合剂（如EDTA）、咪唑和重金属离子的使用。此外，磷酸化氧化锆柱在连续10次重复使用GFP-His纯化后，性能未出现明显下降，证明了其良好的可重复使用性和操作经济性。补充实验还表明，磷酸配体的存在以及使用磷酸盐缓冲液对实现高纯度纯化至关重要，且洗脱液中添加EDTA也不影响纯化效果，这意味着该方法可兼容含有螯合剂的样品，而这通常是IMAC的禁忌。
结论
本研究成功开发并验证了一种基于磷酸化氧化锆颗粒的新型层析方法，用于组氨酸标签蛋白的纯化。该方法的核心优势在于：它利用了His标签与氧化锆颗粒表面磷酸基团之间的静电相互作用，在中性pH条件下即可实现His标签蛋白的高选择性吸附，并仅需高浓度盐溶液（磷酸盐缓冲液）即可有效洗脱。研究结果表明，该方法的纯化纯度与传统的Ni-NTA IMAC方法相当，同时彻底摆脱了IMAC技术对低pH、螯合剂、咪唑和重金属离子的依赖，从而避免了由此可能引发的蛋白质变性、失活、金属离子污染以及试剂干扰等问题。此外，得益于氧化锆无机材料固有的高机械强度、化学稳定性和耐压性，该方法支持高流速操作，能够实现快速、高通量的蛋白质纯化，且层析柱可多次重复使用，降低了纯化成本。因此，磷酸化氧化锆柱层析法是一种具有高纯度、条件温和、操作快速、成本效益高且环境友好等优点的His标签蛋白纯化新策略，有望作为IMAC的有效替代或补充方案，在需要保持蛋白质天然构象和活性的应用场景中（如酶学、结构生物学、治疗性蛋白生产等）发挥重要作用。
研究亮点
其他有价值的内容
研究在讨论部分指出，磷酸化氧化锆对His标签蛋白的高选择性吸附，除了归因于磷酸配体与组氨酸的相互作用外，氧化锆表面本身以及磷酸盐缓冲液的使用也扮演了重要角色，这与之前该材料用于抗体纯化的机理研究相呼应。此外，该方法能够在含有EDTA的条件下工作，这为其在需要去除或抑制金属离子的特殊样品预处理或纯化流程中应用提供了可能性。这些细节进一步拓宽了该技术的应用场景和理解维度。