本文由Yanqiong Liu、Zunyun Fu、Haihong Dong、Jingxuan Zhang、Yingle Mao、Mingyue Zheng和Cangsong Liao等作者共同完成，发表于《Angewandte Chemie International Edition》期刊，2023年。研究团队来自南京中医药大学、中国科学院上海药物研究所和中国科学院大学等机构。该研究聚焦于开发一种绿色、高效的生物催化级联反应，用于从苯甲醛和甘氨酸合成手性扁桃酸（mandelic acid）及其衍生物，旨在替代传统依赖氰化物的有毒合成方法。
手性α-羟基羧酸（chiral α-hydroxy carboxylic acids）是一类在生物活性分子中广泛存在的结构单元，尤其在药物化学和不对称合成中具有重要应用。扁桃酸及其衍生物是其中的典型代表，广泛应用于手性拆分试剂、抗生素（如头孢菌素和半合成青霉素）的合成中。然而，传统的扁桃酸合成方法依赖于氰化物等有毒试剂，且反应条件苛刻，产生大量废弃物。因此，开发一种绿色、可持续的合成方法成为化学工业的长期目标。
生物催化级联反应（biocatalytic cascades）作为一种新兴的合成策略，通过将多个酶反应整合在一个反应体系中，避免了中间产物的分离和纯化，具有高效、选择性高、反应条件温和等优势。近年来，随着酶工具箱的扩展，生物催化级联反应在复杂药物分子和多功能手性构建块的合成中展现出巨大潜力。本文的研究正是在这一背景下展开，旨在开发一种基于酶催化的扁桃酸合成方法，避免使用氰化物，并实现高原子经济性和高对映选择性。
本研究的主要目标是开发一种基于(S)-4-羟基扁桃酸合成酶（HMAS）的生物催化级联反应，用于从苯甲醛和甘氨酸合成扁桃酸及其衍生物。研究流程包括以下几个关键步骤：
酶的选择与改造：研究团队首先从不同来源筛选了多种二氧酶（dioxygenases），包括来自A. orientalis的HMAS及其突变体（AOHMASWT和AOHMASS201V），以及来自P. putida和E. coli的Hgls和Ydcj。通过单点突变，AOHMASS201V实现了对映选择性的反转，能够高效合成®-扁桃酸。
分子动力学模拟：为了解释AOHMASS201V对映选择性反转的机制，研究团队进行了分子动力学（MD）模拟。模拟结果表明，突变体中的芳香环翻转增加了与His241的π-π相互作用，导致Fe与Cα位的pro-®-H距离更近，从而促进了®-扁桃酸的形成。
级联反应的构建：研究团队设计了一个包含L-苏氨酸醛缩酶（LTA）、L-苏氨酸脱水酶（LTD）和二氧酶的三步级联反应。首先，LTA催化苯甲醛与甘氨酸的醛缩反应生成苯丝氨酸；随后，LTD将苯丝氨酸脱水生成苯丙酮酸；最后，二氧酶催化苯丙酮酸的脱羧和羟基化反应，生成扁桃酸。
体外与体内实验：研究团队在体外和体内验证了级联反应的可行性。体外实验表明，级联反应能够高效地将苯甲醛转化为扁桃酸，转化率高达98%。体内实验则利用E. coli作为全细胞催化剂，成功实现了扁桃酸的高效合成，且无需额外添加辅因子。
底物范围与规模化应用：研究团队进一步考察了级联反应的底物范围，发现AOHMASS201V能够耐受多种取代基，合成多种扁桃酸衍生物，且产率和对映选择性均较高。此外，研究团队还成功进行了600 mL规模的克级反应，合成了抗血小板药物氯吡格雷的关键中间体®-2-氯扁桃酸，产率达81%。
酶的选择与改造：AOHMASWT和AOHMASS201V在苯丙酮酸的羟基化反应中表现出高活性，分别合成了(S)-和®-扁桃酸，对映选择性分别为73%和99%。
分子动力学模拟：MD模拟揭示了AOHMASS201V对映选择性反转的机制，表明突变体中的芳香环翻转和Val201的位阻效应是驱动®-扁桃酸形成的关键因素。
级联反应的高效性：体外级联反应在2小时内实现了98%的转化率，体内实验则在8小时内实现了89%的转化率，且无需额外添加辅因子。
底物范围的广泛性：AOHMASS201V能够耐受多种取代基，合成了多种扁桃酸衍生物，产率和对映选择性均较高。特别是对氟、氯、溴等取代基的底物表现出优异的反应性能。
规模化应用的可行性：研究团队成功进行了克级反应，合成了抗血小板药物氯吡格雷的关键中间体®-2-氯扁桃酸，产率达81%。
本研究开发了一种基于HMAS的生物催化级联反应，成功实现了从苯甲醛和甘氨酸高效、绿色地合成扁桃酸及其衍生物。该方法具有高原子经济性、高对映选择性和广泛的底物范围，避免了传统合成方法中氰化物的使用，为扁桃酸及其衍生物的可持续生产提供了新的技术路线。此外，通过对HMAS的单点突变，研究团队实现了对映选择性的反转，为手性分子的立体发散合成提供了新的思路。
本研究还展示了计算机辅助合成规划工具在生物催化级联反应开发中的潜力，为未来酶工程和过程优化提供了新的研究方向。此外，研究团队对级联反应中副产物的控制也进行了深入探讨，为优化反应条件提供了重要参考。
本研究为扁桃酸及其衍生物的绿色合成提供了新的技术路线，具有重要的科学价值和实际应用意义。