一项关于改性芦荟多糖的安全性评估及其促进斑马鱼尾鳍再生的研究
本研究的通讯作者为海南大学海洋生物与渔业学院的叶丁研究员以及广州立塬医药科技有限公司、广东省药物非临床评价与研究重点实验室的李杰婧研究员。研究团队的其他成员来自广州立塬医药科技有限公司、中国科学院水生生物研究所国家水生生物种质资源中心以及海南大学等多个机构。这项研究工作发表在2025年2月的期刊 Carbohydrate Polymer Technologies and Applications (第10卷，文章ID 100709) 上。
学术背景 本研究的核心科学领域是天然产物化学与生物医学工程，特别是针对植物多糖（Polysaccharide）的提取、结构改性及其在组织再生和伤口愈合中的应用。芦荟（Aloe vera，亦称 Aloe barbadensis）作为一种传统草药，其抗炎、促进伤口愈合的功效广为人知，主要归功于其所含的多糖成分。然而，天然芦荟提取物的生物活性（Bioactivity）有限，这极大地限制了其临床应用。此前，研究团队从芦荟提取物中分离出一种均质多糖，命名为 ABPA1。ABPA1 在体外和体内表现出抗肿瘤和免疫调节活性，例如通过调节三羧酸循环（TCA cycle）和氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation， OXPHOS）诱导结直肠癌细胞凋亡，并通过调节巨噬细胞代谢发挥抗炎作用。然而，当团队希望将其研究扩展到更复杂、更系统性的伤口愈合过程时，并未观察到明确的促进愈合表型。这可能是由于ABPA1的水溶性和可消化性较差，难以被除巨噬细胞外的其他细胞类型有效摄取（巨噬细胞可通过吞噬作用摄入多糖）。
因此，为了提升芦荟多糖的生物活性，开发新的提取和改性技术势在必行。本研究的直接动因是偶然发现ABPA1在特定条件下能够自组装形成多糖膜，这为获得新型改性多糖提供了契机。本研究的主要目的有两个：一是利用膜渗透蒸发（Pervaporation）技术，通过自组装制备一种新型的、高乙酰化的芦荟多糖聚合物（ABPA2），并对其结构进行表征；二是在确认其安全性的基础上，初步探究其促进伤口愈合的功能与潜在机制。
详细研究流程 本研究包含三个主要部分：新型多糖ABPA2的制备与结构表征、ABPA2在大鼠体内的安全性评价、以及ABPA2在斑马鱼尾鳍损伤模型中促进再生功能的评估与机制探索。
第一部分：ABPA2的制备、分离与结构表征 1. 制备与分离流程：首先，将约100克已纯化的ABPA1溶解于10升20%的乙醇水溶液中。将该溶液置于80°C恒温的不锈钢敞开式蒸发罐中，在常压下蒸发溶剂。在此过程中，溶液表面会形成一层多糖膜。每8小时收集一次膜，直到不再有膜形成为止，通常可收集3-4次。收集的湿膜经称重后，测定其总固体含量和O-乙酰基含量。然后将所有批次收集的多糖膜合并，参照已发表的方法进行纯化，最终得到一种新的均质多糖，命名为 ABPA2。从ABPA1到ABPA2的产率约为千分之一。 2. 结构表征实验：采用多种技术手段对ABPA2进行系统性的结构鉴定。使用高效凝胶渗透色谱（High-performance gel permeation chromatography， HPGPC）测定其分子量。通过酸水解结合高效液相色谱（HPLC）分析其单糖组成。利用傅里叶变换红外光谱（Fourier infrared spectroscopy， FTIR）和核磁共振（Nuclear magnetic resonance， NMR）光谱（包括1H NMR, 13C NMR, HSQC和HMBC）解析其化学结构和糖苷键连接方式。此外，还通过甲基化分析和气相色谱-质谱联用（Gas chromatography–mass spectrometer， GC–MS）确定糖残基的连接位点。为了比较ABPA1和ABPA2的物理形态差异，研究还使用了扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy， SEM）和3D光学轮廓仪观察它们的微观形貌和表面粗糙度。
第二部分：ABPA2在大鼠体内的安全性评估 此部分分为急性毒性研究和为期6个月的慢性毒性研究，均使用斯普拉格-杜勒（Sprague Dawley， SD）大鼠。 1. 急性毒性研究：选取20只SD大鼠（雌雄各半），随机分为对照组（给予纯水）和ABPA2给药组。由于多糖普遍毒性低、生物相容性好，研究采用了最大可行剂量（Maximum feasible dose， MFD）进行评价。将ABPA2配制成适当浓度，在24小时内通过灌胃给药三次，总剂量为5g/kg（20 ml/kg/次）。给药日定为第0天，随后进行为期14天的观察。每天观察大鼠的一般健康状况、中毒症状和死亡率，每周记录一次体重。在第14天，处死所有大鼠，对主要器官进行大体解剖和组织病理学检查。 2. 慢性毒性研究：选取60只SD大鼠（雌雄各半），随机分为对照组和ABPA2给药组（每组30只，雌雄各半）。基于急性毒性试验未出现死亡的结果，长期毒性实验的剂量设定为1 g/kg/天（急性毒性MFD的1/15）。每天早晨给药一次，持续6个月。在给药中期（第90天）、给药结束（第180天）以及之后为期4周的恢复期结束时（第28天），分别收集大鼠的尿液样本进行尿液分析。并在相应时间点（第91天、第181天、恢复期第29天）分批处死大鼠，采集血液样本进行血液学分析、血液生化分析和凝血功能检测。同时，取心、肝、肾等重要器官称重后固定，进行组织病理学检查；取股骨骨髓进行涂片检查。在整个实验期间，每日观察临床体征，每周记录体重和食物消耗量。
第三部分：ABPA2促进斑马鱼尾鳍再生的功能与机制研究 1. 安全浓度与有效浓度筛选：首先，在斑马鱼幼鱼上测试不同浓度的ABPA2，确定其安全浓度范围。结果显示，0.05%浓度下幼鱼死亡率为0%，因此将该浓度设为最高安全浓度。随后，在安全范围内设置多个浓度梯度，通过测量截肢后不同时间点的尾鳍再生长度，筛选出促进再生效果最优的浓度（0.0375%），用于后续所有功能实验。 2. 尾鳍再生表型验证： * 幼鱼模型：对72小时受精后（hours post-fertilization， hpf）的斑马鱼幼鱼进行尾鳍截肢，然后分别用含0.0375% ABPA2的培养液或普通培养液（对照）处理。在截肢后0, 24, 48, 72, 96, 120小时（hours post-amputation， hpa）在显微镜下拍照，并测量尾鳍长度，计算再生速率。 * 成鱼模型：对3月龄的成年斑马鱼进行半尾鳍截除，用ABPA2或对照液处理9天，在第1、3、5、7、9天拍照并测量再生鳍的长度。 3. 细胞增殖与炎症反应分析： * 细胞增殖：在幼鱼截肢24小时后，用Edu（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）标记增殖细胞10小时，随后固定染色，计数伤口区域的Edu阳性细胞。 * 炎症因子表达：通过实时定量聚合酶链反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）检测截肢后0、3、6、12、24小时伤口区域促炎因子（TNF-α， IL-1β， IL-8）的mRNA表达水平。 * 免疫细胞募集：利用转基因斑马鱼系[Tg(lyz: dsRed2)标记中性粒细胞，Tg2(mpeg1: eGFP)标记巨噬细胞]，在截肢后不同时间点（中性粒细胞观察至8 hpa，巨噬细胞观察至96 hpa），通过荧光显微镜观察并计数聚集在伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞数量。 4. 分子机制探索 - 转录组学分析： * 样本准备与测序：收集截肢后6小时（炎症期）和36小时（修复期）的对照组和ABPA2处理组斑马鱼幼鱼尾鳍组织（每组40条鱼，分为两个生物学重复）。提取总RNA，构建cDNA文库，在Illumina NextSeq 500平台上进行批量RNA测序（Bulk RNA-seq）。 * 数据分析：使用Bowtie2将测序数据比对到斑马鱼参考基因组，用DESeq2进行差异表达基因（Differentially expressed genes， DEGs）分析。对差异基因进行基因本体论（Gene Ontology， GO）富集分析，并使用clusterProfiler软件构建基因-概念网络，以可视化核心功能类别。 * 关键通路验证：根据RNA-seq结果，通过qRT-PCR进一步验证与钙离子转运和线粒体动力学相关基因的表达变化。
主要研究结果 1. ABPA2的结构特征： 成功制备出ABPA2。结构分析表明，其分子量约为350 kDa，主要由甘露糖（92.19%）构成，含有少量木糖和葡萄糖。其主链结构与ABPA1一致，为→4)-β-D-Manp-(1→，但关键区别在于ABPA2的乙酰化程度显著更高。定量分析显示，ABPA2的O-乙酰基含量（219.66 mg/g）远高于ABPA1（58.11 mg/g），乙酰基主要取代在甘露糖的2-O-、3-O-和6-O-位。微观形态上，SEM和3D轮廓仪显示ABPA2的分子排列更有序，表面粗糙度更低，表明其形成了更紧密、熵更低的结构，这解释了其成膜特性。乙酰基的引入既增加了分子的疏水性部分，又通过形成更多氢键增强了分子间作用力。
2. 安全性评估结果： * 急性毒性：在14天观察期内，给予最大可行剂量（5g/kg）ABPA2的大鼠未出现任何异常临床症状或死亡，体重与对照组无显著差异，器官大体解剖未见病变。 * 慢性毒性：在为期6个月的给药及4周恢复期内，所有大鼠均未出现与药物相关的死亡或毒性临床症状。体重和食物消耗量与对照组基本一致。血液生化、尿液和血液学分析中出现的少数有统计学意义的指标变化（如女性大鼠总胆红素暂时性降低），均无剂量或时间依赖性，且在历史背景数据范围内，被认为无毒理学意义。组织病理学检查发现，部分给药大鼠在中期（第90天）出现肝小叶中央肝细胞肥大，但在28天的恢复期后完全恢复正常，表明这是肝脏对药物的适应性可逆变化，而非毒性损伤。心、肾、骨髓等未见异常。综合所有数据，ABPA2在1 g/kg/天的剂量下对SD大鼠是安全的。
3. 促进尾鳍再生的功能结果： * 表型验证：在斑马鱼幼鱼和成鱼模型中，ABPA2处理均显著促进了尾鳍再生。在幼鱼模型中，ABPA2处理组的尾鳍在48、72、120 hpa时均显著长于对照组，且在24至48 hpa期间的日生长速率是对照组的约1.7倍。在成鱼模型中，ABPA2处理组在第7天的再生面积显著大于对照组。 * 细胞增殖与炎症调节：Edu实验表明，在截肢后24-34小时，ABPA2处理组伤口区域的细胞增殖率是对照组的2.3倍。qRT-PCR结果显示，ABPA2在截肢后早期（3小时内）快速上调了TNF-α, IL-1β, IL-8等促炎因子的表达，但随后其表达水平迅速下降并逐渐低于对照组。这表明ABPA2可能加速了炎症阶段的进程。 * 免疫细胞募集：中性粒细胞计数显示，ABPA2对其向伤口的迁移无明显影响。然而，对于巨噬细胞，ABPA2处理组在截肢后早期（12小时内）其数量快速增加并维持在较高水平，但在96 hpa时，其数量已显著低于仍在进行再生过程的对照组，并接近初始水平。这说明ABPA2可能通过促进巨噬细胞的早期快速募集和功能发挥，加速了从炎症阶段向增殖修复阶段的过渡。 * 分子机制洞察：RNA-seq分析发现，在修复期（36 hpa），ABPA2处理上调的基因显著富集于细胞粘附和细胞外基质（Extracellular matrix， ECM）组织相关的功能类别，如“细胞外基质结构成分”、“糖胺聚糖结合”、“肌动蛋白丝结合”等。基因-概念网络图也突出了胶原蛋白、层粘连蛋白、整合素、肌球蛋白等ECM和细胞骨架相关基因。此外，多个钙离子转运蛋白基因表达上调。qRT-PCR验证进一步证实，ABPA2处理能上调线粒体融合（如Mfn1/2）、分裂、自噬及生物合成相关基因（如Pink1， Sqstm1， Ppargc1a）的表达，提示其可能通过调节钙信号介导的机械转导和线粒体动力学来促进代谢适应和组织重建。
结论 本研究通过利用芦荟多糖（ABPA1）在蒸发过程中的自组装特性，成功制备出一种新型的高乙酰化甘露聚糖——ABPA2。系统的急性与慢性毒性研究表明ABPA2具有良好的安全性。功能研究证实，ABPA2能显著促进斑马鱼幼鱼和成鱼的尾鳍再生。其作用机制很可能与以下几点相关：1) 高乙酰化改善了多糖的水溶性和膜形成能力，促进了其与细胞/组织的相互作用；2) 通过诱导伤口处细胞增殖、快速调动巨噬细胞并加速炎症进程，优化了伤口愈合的早期阶段；3) 通过上调细胞外基质重建相关基因的表达、调节钙离子转运以及激活线粒体生物合成和动力学，为组织再生提供了必要的结构支持和代谢动力。这些发现为ABPA2作为一种安全的、具有促进组织修复潜力的新型生物材料提供了初步证据，并揭示了乙酰基在多糖生物活性中的关键作用。
研究亮点 1. 方法创新：首次报道了利用多糖的膜渗透蒸发自组装过程来制备高乙酰化改性多糖的方法。该方法避免使用有毒化学试剂，过程相对绿色，且能保持多糖较高的分子量。 2. 结构-功能关联：明确揭示了乙酰化度对芦荟多糖物理性质（溶解性、成膜性、微观形态）和生物功能（促进伤口愈合）的关键影响，为多糖改性提供了明确的方向。 3. 系统性的研究设计：从新材料的制备、结构表征，到系统的临床前安全性评价（遵循规范毒理学研究流程），再到多层次的功能与机制探索（整体动物表型、细胞行为、炎症反应、转录组学），构成了一个完整且严谨的研究链条。 4. 机制探索的深度：不仅观察到了促进再生的表型，还深入到细胞增殖、免疫细胞动态、基因表达谱、线粒体代谢等多个层面进行机制探讨，将细胞外基质重建、钙信号和线粒体动力学联系起来，提出了一个可能的作用网络。
其他有价值的内容 研究在讨论部分指出，斑马鱼具有很强的再生能力，本研究观察到的积极效果在哺乳动物的伤口愈合中是否同样有效，仍需进一步验证。这为后续研究指明了方向。此外，研究强调了巨噬细胞作为芦荟多糖免疫调节作用的关键靶细胞，以及多糖与伤口表面相互作用（模拟外用芦荟凝胶的经验）可能通过增强细胞粘附来促进巨噬细胞外渗的潜在应用逻辑。