学术研究报告：将IscB和Cas9转化为RNA引导的RNA编辑器

作者及发表信息
本研究由美国耶鲁大学分子生物物理与生物化学系的Chengtao Xu、Xiaolin Niu、Haifeng Sun、Ailong Ke团队，以及芝加哥大学化学系的Hao Yan和Weixin Tang团队合作完成，通讯作者为Ailong Ke（ailong.ke@yale.edu）。研究成果于2025年10月16日发表在期刊《Cell》（卷188，第1-15页）。

学术背景
RNA编辑是基因治疗领域的重要方向，因其不改变基因组DNA，可避免遗传性脱靶风险。目前主流的RNA编辑工具CRISPR-Cas13存在显著的细胞毒性问题，其旁切RNA切割活性会非特异性降解宿主mRNA，限制临床应用。IscB是Cas9的进化祖先，属于IS200/605转座子家族的RNA引导内切酶，具有超紧凑结构（约为Cas9的1/3大小），但其天然形式以DNA为靶标。本研究旨在通过工程化改造IscB，开发一种高效、低毒性的RNA编辑平台，并探索类似策略在Cas9中的应用。

研究流程与方法
1. IscB的RNA结合特性验证
- 实验设计：通过电泳迁移率实验（EMSA）验证野生型IscB对单链DNA（ssDNA）和RNA（ssRNA）的亲和力，发现其虽能结合ssRNA，但更偏好双链DNA（dsDNA）。竞争实验表明，dsDNA可完全抑制ssRNA结合。
- 关键发现：IscB的靶标相邻基序（TAM）相互作用域（TID）是DNA结合的关键，删除TID（构建ΔTID突变体）可完全消除DNA结合能力，同时保留ssRNA结合活性（解离常数Kd=29 pM）。

1. 工程化改造：构建r-IscB

   • 结构指导设计：基于IscB晶体结构（PDB: 7UTN），删除TID域（aa433-487），并测试替代方案（如替换为大肠杆菌PNPase的S1结构域）。
     
   • 功能验证：r-IscB（ΔTID）在体外展示出与Cas13相当的RNA结合效率，且无DNA切割活性。单分子动力学实验显示其与靶RNA复合物的半衰期达37分钟，远高于Cas13的瞬时结合。
     

2. RNA编辑应用验证

   • 剪接调控：在HEK293T细胞中，r-IscB通过靶向PKM基因的剪接位点（如exon 10的3’端），选择性下调PKM2亚型（效率达2.8倍），优于反义寡核苷酸（ASO）。在杜氏肌营养不良症（DMD）模型中，靶向exon 51的r-IscB实现6-8倍的mRNA剪接校正。
     
   • 转剪接修复：利用GFP报告系统，r-IscB介导的5’转剪接效率达40.9%，可修复内含子中的无义突变。
     
   • A-to-I编辑：融合ADAR2脱氨酶的r-IscB在mRNA中实现高效腺苷-to-肌苷编辑（编辑效率12%），且脱靶率极低（背景编辑<0.2%）。
     
   • RNA切割增强：通过结构引导的HNH结构域改造（H243E/R270Q突变），r-IscB获得RNA切割能力，在PCK9和EZH2基因中实现>80%的mRNA敲降。
     

3. Cas9的RNA编辑器转化

   • 跨物种扩展：删除NmeCas9的PAM相互作用域（PID）后，其RNA切割活性被激活，在人类细胞中实现EZHA mRNA敲降（效率达13.1%）。该策略成功推广至Sacas9、CjCas9和Cas9d，其中Cas9d因体积最小（700 aa）最具应用潜力。
     

主要结果与逻辑关联
- 核心发现：TID/PID的删除或破坏可解除IscB/Cas9的DNA结合限制，激活其RNA靶向能力。r-IscB在剪接调控、转剪接和碱基编辑中均优于Cas13，且无细胞毒性（Cas13处理组24小时内细胞存活率显著下降）。
- 数据支持：单分子结合实验（图2g）、qPCR定量（图3c）、RNA-seq转录组分析（图5h）等证实r-IscB的高效性和特异性。例如，在ADARB1靶向实验中，差异表达基因富集于RNA剪接通路，而非脱靶效应。

结论与价值
1. 科学价值：揭示了IscB/Cas9的RNA编辑潜能，提出“结构域删除”普适性策略，为CRISPR工具开发提供新范式。
2. 应用价值：r-IscB的小尺寸（<500 aa）适合AAV载体递送，其长时程结合特性（半衰期37分钟）支持单次给药长效治疗。例如，DMD的转剪接策略可一次性修复多种突变，简化临床开发流程。
3. 临床意义：规避Cas13的毒性问题，为显性负性疾病（如PKM2过表达癌症）和隐性遗传病（如DMD）提供安全治疗方案。

研究亮点
- 创新性方法：首次通过TID删除实现IscB向RNA编辑器的转化，并拓展至Cas9家族。
- 性能优势：r-IscB的编辑效率（如转剪接40.9%）和特异性（种子区错配敏感度）超越Cas13。
- 多场景适用性：覆盖剪接调控、碱基编辑、RNA切割等多种应用，且兼容AAV递送。

其他价值
研究还发现，Cas9d的PID删除变体在RNA靶向中表现优异，为超紧凑RNA编辑器开发指明方向。团队已通过Addgene共享质粒资源，推动领域发展。

（注：文中术语首次出现时标注英文，如“靶标相邻基序（TAM）”“腺苷-to-肌苷（A-to-I）编辑”等。）