本研究由南京中医药大学医学与整合医学学院免疫学系的刘金凤（Jinfeng Liu）、向佳欣（Jiaxin Xiang）以及浙江树人大学转化医学研究所、南京中医药大学药学院的史丽云（Liyun Shi）等研究者合作完成。论文发表于《Journal of Nanobiotechnology》2023年第21卷，文章编号78，DOI为10.1186/s12951-023-01835-0。该研究首次揭示了药用植物黄花蒿（Artemisia annua）来源的纳米囊泡通过递送植物线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）至哺乳动物免疫细胞，激活cGAS-STING通路，从而重塑肿瘤微环境并增强抗肿瘤免疫的全新跨物种调控机制。
植物来源纳米囊泡（plant-derived nanovesicles, PDNVs）已被认为是跨物种（inter-kingdom）信息交流与物质传递的重要机制，然而囊泡内所包裹的效应分子及其作用机理在很大程度上仍未阐明。黄花蒿作为抗疟药物青蒿素的来源植物，其提取物及青蒿素衍生物已被证实具有抗炎、抗病毒、抗纤维化及抗肿瘤等多种生物学活性，尤其在调节免疫细胞（如T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞）的分化与功能方面展现出潜力。然而，由于产量有限、生物相容性不足以及作用机制不明等技术瓶颈，青蒿素类药物作为抗肿瘤或免疫调节剂的临床应用受到制约。
cGAS-STING通路是细胞内识别双链DNA（dsDNA）并启动固有免疫应答的核心信号轴。cGAS识别胞质dsDNA后催化合成第二信使环化GMP-AMP（cGAMP），进而激活STING，随后通过TBK1-IRF3和NF-κB通路诱导I型干扰素（type I interferon, IFN-I）及促炎细胞因子的表达。鉴于进展期肿瘤常表现为免疫“冷”状态，激活cGAS-STING通路被认为是“唤醒”肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）等耐受性免疫细胞的潜在策略。已有研究表明哺乳动物细胞可通过外泌体样囊泡传递线粒体DNA以激活STING通路，但药用植物来源的含DNA囊泡能否调控哺乳动物免疫细胞以影响抗肿瘤免疫，在此前从未被探索。本研究旨在从黄花蒿中分离并鉴定纳米囊泡，探究其抗肿瘤活性及具体的效应分子和作用机制。
本研究构建了从囊泡分离纯化、体内外功能验证到分子机制解析的完整研究框架，主要包含以下实验环节：
1. 黄花蒿来源纳米囊泡（ADNVs）的分离、纯化与表征。 研究者采用差速离心结合蔗糖密度梯度超速离心的方法，从新鲜黄花蒿中分离外泌体样囊泡。梯度离心后可见四条条带，主要集中于30%蔗糖界面。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）显示囊泡呈球形双层膜结构；纳米粒度分析测得平均水合粒径为106.8 nm，浓度约为1.25×10¹¹个/mL；Zeta电位为−22.5 mV。琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE证实囊泡内包裹有大量核酸和蛋白质。CCK-8和乳酸脱氢酶（LDH）实验显示ADNVs在高达160 μg/mL的剂量下对小鼠巨噬细胞无明显细胞毒性；体内以25 mg/kg剂量腹腔注射两周后，心、肝、脾、肺、肾及肠道均未见明显组织损伤，血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平亦无显著升高。
2. ADNVs对小鼠肺癌模型的抗肿瘤作用评估。 研究者通过皮下接种Lewis肺癌（LLC）细胞建立C57BL/6小鼠肺癌模型，于接种后第7天开始每3天腹腔注射ADNVs（25 mg/kg），持续2周。结果显示ADNVs处理组肿瘤体积和重量均显著小于对照组，组织学检查可见肿瘤细胞密度降低、核固缩等凋亡特征；增殖标志物Ki67和转移相关分子MMP9的表达明显下降。体内示踪实验将Dil荧光标记的ADNVs注射至荷瘤小鼠，24小时后经Odyssey成像发现ADNVs除在肝脏富集外，在肿瘤组织中也有显著聚集。不同给药途径的比较显示，瘤内注射和静脉注射的递送效率及肿瘤抑制效果与腹腔注射相当，而皮下注射效果微弱。
3. ADNVs对肿瘤微环境及巨噬细胞表型的调控分析。 基因表达谱分析表明，ADNVs处理显著上调肿瘤组织中促炎细胞因子、白细胞趋化因子、I型干扰素及干扰素刺激基因（ISGs）的表达，并增强树突状细胞成熟和T细胞启动相关基因。流式细胞术检测显示ADNVs处理升高了M1型巨噬细胞（CD86⁺CD11b⁺F4/80⁺）比例，降低M2型（CD206⁺CD11b⁺F4/80⁺）比例；免疫荧光染色亦证实iNOS（M1标志物）表达上调而Arg1（M2标志物）表达下调。同时，肿瘤内CD8⁺T细胞尤其是颗粒酶B⁺细胞毒性T细胞比例显著增加。
4. 巨噬细胞在ADNVs抗肿瘤效应中的关键作用验证。 研究者使用氯膦酸脂质体（clodronate liposomes, CL）特异性清除荷瘤小鼠体内的TAMs。结果显示，清除TAMs后ADNVs的肿瘤抑制效应显著减弱，表明囊泡重塑后的巨噬细胞是抑癌效应的关键执行者。进一步采用过继转移实验，将经ADNVs预处理的M2型巨噬细胞回输至荷瘤小鼠，发现接受ADNVs预处理巨噬细胞的小鼠肿瘤生长明显减缓。体外摄取实验显示ADNVs被骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）摄取效率显著高于LLC、CT26及HEK293T等其他细胞系，且主要定位于细胞质。ADNVs处理可促进M2向M1的表型转换，升高TNF-α和IL-6分泌水平，并增强巨噬细胞活性氧（ROS）的产生。
5. cGAS-STING通路的激活机制研究。 蛋白免疫印迹显示ADNVs处理显著增强M2巨噬细胞中STING、TBK1、IRF3和p65的磷酸化水平。在STING基因敲除的goldenticket（Sting^gt/gt^）小鼠巨噬细胞中，ADNVs诱导M2向M1转换的能力被显著削弱。体内实验亦证实，过继转移至荷瘤小鼠的Sting^gt/gt^巨噬细胞在ADNVs处理后不能完成M1表型转换。
6. 植物来源mtDNA的鉴定与功能验证。 PCR分析显示ADNVs中仅检测到线粒体基因cox3，而核基因cox2和叶绿体基因rbcl均未扩增，表明囊泡特异性包裹线粒体DNA。DRAQ5标记实验证实含DNA囊泡可被巨噬细胞摄取。从ADNVs处理小鼠肿瘤中分离的TAMs内检测到显著升高的cox3水平。用溴化乙锭（ethidium bromide, EtBr）选择性耗竭ADNVs中的mtDNA后，囊泡激活STING通路及诱导M1极化的能力均受到显著抑制；体内实验中mtDNA耗竭的ADNVs抑瘤效果亦大幅减弱。此外，将提取的裸mtDNA与脂质体包裹的mtDNA分别作用于M2巨噬细胞，发现裸mtDNA不能诱导M1极化，而脂质体包裹的mtDNA则能有效促进CD86⁺巨噬细胞生成，提示囊泡脂质膜结构对于mtDNA的免疫刺激活性至关重要。
7. ADNVs与PD-L1免疫检查点抑制剂的联合治疗评估。 在LLC荷瘤小鼠模型中，ADNVs与抗PD-L1抗体（αPD-L1）联合治疗组的肿瘤抑制效果显著优于αPD-L1单药组。联合治疗进一步增强了TAMs中STING通路激活及M1极化，并增加了肿瘤内CD4⁺和CD8⁺T细胞的浸润。
本研究成功从黄花蒿中分离纯化了纳米囊泡ADNVs，并系统证明了其通过重塑TAMs表型发挥抗肿瘤作用的完整机制链条。ADNVs在体内外均表现出良好的生物安全性，能够高效靶向肿瘤组织并被TAMs优先摄取。机制上，ADNVs包裹的植物来源mtDNA经囊泡递送进入巨噬细胞胞质后，激活cGAS-STING通路，驱动TBK1-IRF3和NF-κB信号轴，诱导促炎细胞因子和I型干扰素表达，促使TAMs从免疫抑制的M2表型向促炎的M1表型转换，进而增强细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的肿瘤杀伤功能。此外，ADNVs处理可降低TAMs表面PD-L1表达，与αPD-L1抗体联用产生协同抗肿瘤效应。
本研究的科学价值在于首次揭示了药用植物来源的mtDNA通过纳米囊泡介导的跨物种信息传递机制，即植物mtDNA被哺乳动物免疫细胞摄取后激活STING通路以重建抗肿瘤免疫。这一发现不仅拓展了对PDNVs作用模式的认识——以往研究多聚焦于微小RNA（miRNAs），还为cGAS-STING通路的天然配体来源提供了新视角。在应用层面，ADNVs作为天然来源的纳米制剂，兼具脂溶性、膜通透性、抗核酸酶降解能力以及良好的安全性和生物相容性，相较于传统STING激动剂（如环二核苷酸）具有显著优势。本研究为开发基于植物纳米囊泡的抗肿瘤治疗策略，特别是与免疫检查点抑制剂或其他免疫疗法联用，提供了重要的理论依据和实验基础。
首次发现药用植物mtDNA作为跨物种免疫调节的效应分子：本研究在PDNVs领域首次鉴定出线粒体DNA而非miRNA是介导免疫调节的关键活性成分，填补了植物囊泡效应分子认知的空白。
完整的机制链条验证：从囊泡分离表征、体内分布、细胞靶向、表型重塑到分子通路激活及功能验证，研究构建了从现象到机制的完整证据链，尤其通过mtDNA耗竭和STING敲除等反向验证实验强化了因果推断。
天然囊泡作为STING激动剂的独特优势：ADNVs的脂质膜结构保护mtDNA免受降解并促进细胞摄取，克服了传统STING激动剂膜通透性差的缺陷，为天然纳米载体的开发提供了新思路。