本综述由Julia Rädler、Dhanu Gupta、Antje Zickler和Samir EL Andaloussi共同撰写。通讯作者为Samir EL Andaloussi，任职于瑞典卡罗林斯卡医学院（Karolinska Institutet）检验医学系生物分子与细胞医学部。该文发表于*Molecular Therapy*期刊2023年5月第31卷第5期，文章DOI为10.1016/j.ymthe.2023.02.013。Dhanu Gupta同时隶属于牛津大学儿科系，Samir EL Andaloussi为Evox Therapeutics Ltd的联合创始人及股东。
本文是一篇学术综述，系统梳理了细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）生物发生机制及其在生物工程改造与治疗性货物装载中的应用。细胞外囊泡是由所有细胞分泌的天然膜包被纳米颗粒，作为细胞间通讯的重要媒介，能够以蛋白质、脂质、核酸甚至细胞器的形式向周围或远处细胞传递信息。近年来，EVs因良好的安全性、独特的生物分布能力以及穿越生物屏障的能力，被视为优于合成纳米载体的药物递送平台。然而，EVs的广泛应用受限于技术缺陷和对其异质性认识的不足。深入理解EVs的生物发生机制，是解锁其治疗潜力的关键。本综述的核心目的是分析已知的EV生物发生调控因子，并探讨如何利用这些知识进行EV生物工程改造，以装载治疗性蛋白质或核酸货物。
外泌体（exosomes，50–200 nm）的经典生物发生途径始于内溶酶体系统中多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）的形成。MVBs在内体成熟过程中由Rab GTPases介导，特别是Rab5向Rab7的转换。在早期内体向晚期内体过渡期间，限制膜向内出芽形成腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs）。这一过程由多种机制驱动：首先，内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）系统由四个亚基（ESCRT-0、-I、-II和-III）依次作用——Hrs识别泛素化蛋白和磷脂酰肌醇3-磷酸（PtdIns3P），通过TSG101招募ESCRT-I，ESCRT-II驱动膜内陷，ESCRT-III完成膜剪切，VPS4促进ESCRT-III解离以循环利用。然而，敲低ESCRT组分并不能完全消除外泌体产生，表明存在替代通路。其次，四跨膜蛋白（tetraspanins）如CD63、CD81和CD9通过聚集形成富四跨膜蛋白微区参与ILV形成。其中CD63被发现与Hrs在ILV形成中相互竞争，暗示含四跨膜蛋白的外泌体产生不依赖经典ESCRT机制。第三，syndecan-syntenin-ALIX通路利用ESCRT-III和VPS4，但不需要ESCRT-0或泛素化——syndecan招募syntenin，后者与ALIX相互作用促进ILV生物发生，而syntenin又受ARF6和磷脂酶D2（PLD2）调控。第四，神经酰胺通路——中性鞘磷脂酶2（nSMase2）水解鞘磷脂生成神经酰胺，启动膜弯曲；抑制nSMase2可减少外泌体释放，诱导神经酰胺则增加释放。综述在表1中系统比较了77项研究，涵盖不同调控因子、细胞类型、干预方法和效应，揭示了MVB形成的复杂性和通路冗余性。
MVB形成后的去向——降解或分泌——在很大程度上由其形成方式预先决定。蛋白质泛素化、TSG101的ISGylation修饰以及四跨膜蛋白6（tetraspanin-6，作为syntenin的负调控因子）均引导MVB走向降解途径。这支持了以下观点：ESCRT依赖的MVB形成通常与降解性MVB相关，而syndecan-syntenin-ALIX通路与分泌性MVB相关。此外，溶血双磷脂酸（LBPA）作为ALIX的伴侣分子，也被认为参与ILV的命运调控。自噬相关（autophagy-related，ATG）蛋白通过降低MVB酸化或与ALIX相互作用并刺激其活性来参与外泌体产生。MVB向质膜的转运是一个活跃过程，由分子马达驱动并受Rab GTPases的时空协调。例如，cortactin作为分支肌动蛋白动力学的调控因子，控制MVB在质膜的对接。Rab11在K562细胞中调控外泌体释放，但在HeLa细胞中不影响外泌体产生，表明Rab GTPases以细胞类型依赖的方式调控外泌体分泌。MVB与质膜的融合由SNARE蛋白驱动——VAMP7、YKT6、SNAP23和syntaxin-4参与其中，钙离子也被证明是K562细胞中MVB融合的必要条件。此外，小GTPase Ral1通过招募syntaxin 5促进MVB与质膜融合，RalA/B则通过PLD1作用于MVB稳态和外泌体分泌。
与广泛研究的外泌体相比，微囊泡（microvesicles，MVs，0.1–1 μm）直接从质膜出芽形成，其调控机制了解较少。小GTPases家族成员参与了这一过程：ARF6激活在黑色素瘤细胞中增强MV产生，依赖于其下游效应物PLD、ERK和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的激活；在HeLa细胞中，RhoA及其效应物（ROCK、LIMK、cofilin）参与MV形成；ARF1作为Rho家族的上游调控因子，在MDA-MB-231细胞中调控MV脱落。酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）是神经酰胺的另一个调控因子（区别于参与外泌体生物发生的nSMase），在ATP刺激的小胶质细胞MV产生中发挥关键作用，该过程依赖P2X7受体激活、p38磷酸化和ASM活化。此外，红细胞中的MV生成同样与ASM相关。最后，含arrestin结构域蛋白1（ARRDC1）介导的MV形成与病毒Gag诱导的膜脱落共享机制——两者都需要TSG101和VPS4的辅助以及质膜定位。
EVs携带广泛的跨膜蛋白、膜相关蛋白和腔内可溶性蛋白。大规模蛋白质组学研究显示，来自不同细胞来源的EV蛋白质组大部分相似，富集于参与EV生物发生的蛋白，仅少数反映细胞类型特异性。四跨膜蛋白家族（CD81、CD63、CD9、CD82、CD37）高度富集于EVs，可促进整合素、ICAM-1、MHC II类蛋白等相互作用蛋白的分选。此外，糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白、异戊烯化蛋白、肉豆蔻酰化蛋白以及泛素化、SUMO化和磷酸化等翻译后修饰均参与货物分选。RNA货物分选机制分为被动和主动两类：被动装载依赖于细胞内RNA浓度，主动装载则由特定序列基序（如exomotifs中的CGGGAG）和RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）介导。已鉴定的RBPs包括YBX1、Syncrip、AGO2、ALIX、MVP、hnRNPU和ANXA2等。此外，RNA的SUMO化、磷酸化和LC3缀合等修饰也构成额外的分选信号。与RNA相比，EV相关DNA的研究较少，主要包括基因组双链DNA、单链DNA、线粒体DNA和病毒DNA，但其真实生物学意义仍存在争议，部分研究者认为EV相关DNA可能源于纯化不足的污染。
基于对EV生物发生的理解，研究者开发了多种内源性生物工程策略。对于腔内蛋白装载，策略是将目标蛋白与EV分选支架融合表达。作者团队此前系统比较了12种内源性工程支架，发现四跨膜蛋白CD63、CD81和CD9装载EGFP效率最高——CD63每个囊泡可装载40–60个EGFP分子；最近有研究利用TSPAN14实现了每个囊泡150个分子的装载。其他有效的分选结构域包括syntenin、ARRDC1、BASP-1、syndecan-1和HIV-I Nef蛋白。为克服直接融合可能导致的功能丧失，已开发了光诱导二聚化系统和小分子控制蛋白关联系统，实现货物装载后的释放。基于这些策略，EVs已被工程化用于递送CRISPR-Cas9、IκBα超抑制因子、Cre重组酶和溶酶体酶。对于表面蛋白工程，LAMP2是最广泛使用的支架之一，但其标记局限于内溶酶体来源的囊泡群体且工程效率高度依赖生产细胞类型。四跨膜蛋白的第二胞外环高度模块化，可用于配体展示——作者团队利用该策略展示白蛋白结合结构域，显著延长了EVs的体内循环时间。PTGFRN作为另一个表面工程支架，可实现每个EV高达1,000个工程分子的装载。此外，GPI锚和磷脂酰丝氨酸结合蛋白（如MFGE8）也可用于表面工程。对于核酸货物装载，早期方法基于小RNA的过表达；随着对RNA分选机制认识的加深，核酸结合蛋白与EV分选蛋白融合的策略被广泛应用。siRNA整合入Dicer非依赖的pre-miR-451茎环可提高装载效率并显著降低靶细胞中有效基因沉默所需的siRNA剂量。对于较长RNA如mRNA，CD9-锌指融合蛋白实现了选择性装载，效率高达每个EV一个mRNA拷贝。
本综述的学术价值在于系统整合了来自77项研究的EV生物发生调控因子数据，揭示了外泌体和微囊泡形成通路的复杂性、冗余性以及刺激和货物依赖性。该综述明确指出，MVB形成涉及多条可相互替代的通路，且不同通路可能产生具有不同组成和功能的EV亚群。在应用层面，这篇综述为EV生物工程改造提供了理论框架——通过“劫持”天然生物发生机制，可以实现治疗性蛋白质和核酸的高效内源性装载。作者还指出了该领域面临的关键挑战：EV异质性的表征困难、不同EV亚群对货物装载能力的差异、以及临床转化中大规模GMP级生产和纯化技术的不足。特别值得关注的是，综述强调了目前缺乏统一的核酸定量和报告标准，导致不同研究间的比较几乎不可能。此外，对于全长mRNA在EV中的物理容量限制——小于1,000个核苷酸的转录本在小EV中几乎不存在——这一观察对EV作为mRNA递送载体的可行性提出了重要问题。最后，非遗传性源细胞修饰方法（如代谢标记、膜融合脂质体、细胞吞噬回收等）为规避基因工程的安全风险提供了有价值的替代方案。