低温保存技术中DMSO对人类骨髓间充质干细胞的影响：一项关于细胞完整性、功能及潜在风险的综合研究

作者与发表信息

本研究由Yanqin Ding、Shuo Liu、Jianting Liu、Shenglin Jin和Jianjun Wang等作者共同完成。作者单位包括中国科学院理化技术研究所跨学科研究中心、中国科学院化学研究所绿色印刷重点实验室、中国科学院大学化学与化学工程学院以及松山湖材料实验室。该项研究成果于2024年1月19日在线发表在Cryobiology期刊第114卷，文章编号为104847。

研究背景与目标

本研究属于细胞生物学与低温生物学交叉领域，聚焦于细胞疗法中一个关键的瓶颈环节——细胞的长期保存。随着细胞疗法（如干细胞治疗、免疫细胞治疗）在感染、自身免疫性疾病、癌症和代谢疾病等领域展现出巨大潜力，被视为继药物、生物制品和医疗器械之后的医疗新支柱。为了满足临床对细胞产品“现成可用”（off-the-shelf availability）的需求，保证其高质量、高安全性及功能一致性，低温保存（Cryopreservation, CP）成为一种不可或缺的技术。它能通过建立可控的质量标准和细胞库来解决细胞供应链的挑战。

在低温保存过程中，为了防止冰晶形成、生长/重结晶以及由此产生的渗透压休克对细胞造成损伤（即“冷冻损伤”），必须使用冷冻保护剂（Cryoprotectants, CPAs）。二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide, DMSO）是目前基础研究和临床实践中应用最广泛的冷冻保护剂。然而，其临床应用存在严重争议，因为输注含有DMSO的细胞治疗产品可能导致心脏、神经和胃肠道系统的不良反应。尽管已有大量研究探讨了作为培养基添加剂的低剂量DMSO对各种细胞系在结构、过程和遗传稳定性方面的影响，但DMSO作为冷冻保护剂对广泛应用的人类骨髓间充质干细胞（Human Bone Mesenchymal Stem Cells, hBMSCs）的各项关键属性和功能有何全面影响，此前尚未有系统性的深入研究。

因此，本研究旨在全面评估DMSO对hBMSCs低温保存的安全性。研究团队基于几个核心考量设计了实验：首先，冻存细胞的活力和活细胞回收率必须满足移植前的质控要求。其次，遗传稳定性至关重要，因为遗传畸变与癌症发生密切相关，同时DNA损伤可能影响细胞周期、诱导细胞凋亡，并损害分化和迁移能力。最后，已有报道指出冻融过程会产生超生理水平的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），这可能是诱导DNA损伤、细胞凋亡和细胞周期停滞的主要原因之一。基于此，本研究系统性地评估了使用含10% DMSO的商业化冻存培养基（CS10）进行低温保存后，hBMSCs在细胞活力、凋亡、DNA完整性、细胞周期、ROS水平、表面标志物、分化潜能以及迁移能力等方面的变化。

详细研究流程与方法

本研究设计了一套完整、多层次的实验流程，旨在从不同维度揭示DMSO低温保存对hBMSCs的全面影响。

第一， 细胞培养与冻融标准流程。 研究对象为商用hBMSCs（来自iCell Bioscience Inc.）。研究中使用第3至第6代的细胞。实验设置新鲜细胞组作为平行对照。低温保存采用广泛使用的慢速降温法。具体操作为：将5 × 10^5个细胞悬浮于500 µl含10% DMSO的冻存培养基（CS10，简称D10）中，在室温和4°C条件下各平衡10分钟。然后将细胞转移至程序化冷冻容器中，置于-80°C冰箱中以约-1.0°C/分钟的速率缓慢降温，最后转移至液氮（-196°C）中保存24小时至一周。复苏时，将冻存管迅速浸入37°C水浴中约2分钟。

第二， 细胞活力、回收率、增殖与凋亡评估。 1. 即时活力与活细胞回收率：使用吖啶橙（Acridine Orange, AO）/碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）双染法，通过显微镜观察和计数评估解冻后细胞的即时活力。活细胞回收率通过比较冻融前后的细胞数量计算得出。 2. 细胞增殖能力：在冻融后通过离心去除D10，然后使用CCK-8法检测细胞在24、48、72小时的增殖情况，并与新鲜细胞组进行比较。 3. 细胞凋亡分析：采用Annexin V-FITC/PI双染法，结合流式细胞术，定量分析冻融后（包括第3代和第6代细胞）的早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞比例。

第三， DNA损伤/修复与细胞周期分析。 1. DNA损伤检测：这是本研究的重点和特色环节。研究评估了两种常见临床相关场景下的DNA损伤：a) 冻融后不洗涤去除DMSO，直接使用含有约2% DMSO残留的培养基进行培养；b) 冻融后离心去除D10，再使用无DMSO的培养基培养。使用免疫荧光染色法检测DNA双链断裂的标志物——磷酸化的组蛋白H2A.X（γH2AX）。分别在培养后12、24、48、72小时固定细胞，使用γH2AX一抗和Alexa Fluor 568标记的二抗进行染色，细胞核用DAPI复染。通过荧光显微镜采集图像，并定量分析γH2AX与DAPI的荧光强度比值，以此评估相对DNA损伤程度。每个实验组分析超过1000个细胞，实验重复三次。 2. 细胞周期分析：使用PI染料染色DNA，通过流式细胞术分析冻融后（去除D10）培养12、24、48、72小时的细胞周期分布（G0/G1期、S期、G2/M期），并与新鲜细胞对照。

第四， 活性氧（ROS）水平测定。 为评估冻存过程本身（包括CPA添加和冻融循环）引起的氧化应激，研究检测了三个时间点的ROS水平：1) 新鲜细胞；2) 在D10中平衡30分钟（模拟冻存前操作）；3) 立即冻融后的细胞。使用氧化敏感荧光探针DCFH-DA装载细胞，通过流式细胞术检测细胞内的荧光强度，以此反映ROS水平。

第五， 细胞表型与分化能力检测。 1. 表面标志物分析：使用流式细胞术检测冻融后hBMSCs的典型表面抗原表达，包括阳性标志物CD90、CD73、CD105、CD44，以及阴性标志物CD34，以验证其干细胞特性是否因冻存而改变。 2. 成脂与成骨分化潜能评估：这是一个精心设计的多条件实验。研究设置了不同的DMSO残留浓度以模拟临床操作：a) 冻融后不洗涤，使用含约2% DMSO的培养基进行扩增和诱导分化；b) 冻融后稀释DMSO至培养液中残留约0.5%，再行扩增和诱导。新鲜细胞作为对照。分别使用成脂和成骨诱导培养基诱导分化21天。在第21天，分别用油红O（Oil Red O）染色脂滴、茜素红（Alizarin Red）染色钙结节，通过显微镜观察分化情况。更重要的是，在诱导分化的第5天和第10天，通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测成脂关键基因PPARγ和成骨关键基因Runx2的表达水平，以量化分化能力的变化。

第六， 细胞迁移能力与细胞骨架检测。 1. 划痕愈合实验：在细胞培养皿中制造划痕，使用AO染料活染细胞，通过荧光显微镜在24、48、72小时拍摄划痕区域。使用Image J软件分析划痕区域的荧光强度，计算细胞迁移/愈合率。 2. F-肌动蛋白（F-actin）表达分析：细胞培养12小时后，使用phalloidin荧光染料标记F-actin，通过免疫荧光显微镜观察细胞骨架形态，并通过流式细胞术定量分析其平均荧光强度，以评估细胞骨架的合成与组装能力。

第七， 数据分析。 所有数据均以均值±标准差表示。使用SPSS Statistics 23.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）以评估组间差异。统计学显著性设定为*P < 0.05和**P < 0.01。

主要研究结果与发现

1. 低温保存降低细胞活力并诱导凋亡。 与新鲜细胞（92.58 ± 0.5%）相比，冻融后hBMSCs的即时活力显著下降约10%（83.77 ± 1.4%）。活细胞回收率下降约20%，表明冻融过程导致了细胞数量的损失。细胞增殖能力在冻融后72小时内虽逐渐恢复，但仍显著低于同期的新鲜细胞。流式细胞术凋亡分析显示，使用D10冻存后，hBMSCs的凋亡细胞比例（第3代21.92 ± 1.8%，第6代16.32 ± 1.2%）相较于新鲜细胞（第3代8.39 ± 0.4%，第6代7.19 ± 0.8%）增加了10-15%。这直接解释了细胞活力和回收率下降的原因。

2. DMSO冻存造成显著DNA损伤并导致细胞周期停滞，且DMSO残留加剧损伤。 DNA损伤的结果是本研究的核心发现之一，揭示了不同操作流程下的显著差异： * 含DMSO残留培养：当冻融后不洗涤，直接在含约2% DMSO的培养基中培养时，细胞DNA损伤在48小时达到峰值，相对DNA损伤值高达约60，是新鲜细胞的数十倍，至72小时有所下降，表明存在部分修复，但损伤水平依然极高。 * 去除DMSO后培养：冻融后离心去除D10再培养，DNA损伤程度显著降低。虽然在48小时和72小时，损伤水平仍分别为新鲜细胞的1.5倍和2.15倍，但远低于含DMSO残留的培养组（分别降低了约3.8倍和3.65倍）。这一结果强烈提示，冻存介质中残留的DMSO是导致解冻后细胞持续遭受严重DNA损伤的关键因素。 * 细胞周期影响：无论是否去除DMSO，冻融后24小时内，大部分hBMSCs都停滞在G0/G1期（比例显著高于新鲜细胞），细胞周期进程延迟。直到培养48小时后，细胞周期分布才逐渐恢复正常。这表明低温保存过程本身（可能由ROS等因素介导）足以造成细胞周期紊乱，而DMSO残留则会进一步放大DNA层面的损伤。

3. 冻存过程显著提升细胞内ROS水平。 实验发现，仅仅将细胞在D10冻存液中平衡30分钟，其ROS水平就已升至新鲜细胞的1.5倍。而完成整个冻融循环后，立即解冻细胞的ROS水平更是飙升至新鲜细胞的5倍。这证明冻存剂的添加和冻融过程本身都会诱发强烈的氧化应激。高水平的ROS是导致DNA损伤、细胞凋亡和周期停滞的公认诱因，本研究结果为此提供了直接证据。

4. 表型基本维持，但分化与迁移功能严重受损，且受DMSO残留浓度影响巨大。 流式分析表明，冻融后hBMSCs的表面标志物（CD90, CD73, CD105, CD44阳性，CD34阴性）表达谱与新鲜细胞基本一致，说明其基本“身份”未变。 然而，其功能学特性受到了显著影响： * 分化潜能：当培养液中DMSO残留为2%时，成脂和成骨诱导几乎完全失败，细胞大量死亡，相关基因（PPARγ, Runx2）表达极低。当DMSO残留降至0.5%时，细胞能够分化为脂肪细胞和成骨细胞，但分化效率显著降低：形成的脂滴和钙结节更少，PPARγ和Runx2基因的表达水平也明显低于新鲜细胞。这表明，即使低浓度的DMSO残留，也会实质性削弱hBMSCs的分化能力。 * 迁移能力：划痕实验显示，冻融后细胞的迁移/愈合能力在24、48、72小时均显著低于新鲜细胞，尤其在24小时，愈合率仅为新鲜组的约五分之一。同时，与细胞迁移密切相关的细胞骨架蛋白F-actin的表达量，在冻融后细胞中下降了约一半。这从结构和功能两方面揭示了冻存导致细胞迁移能力下降的机制。

研究结论与价值

本研究系统而深入地揭示了使用DMSO进行低温保存对hBMSCs产生的多重负面影响，超越了传统上仅关注细胞存活率的评估框架。主要结论如下：

1. 安全性风险：DMSO冻存不仅造成约10-15%的细胞额外凋亡和约20%的细胞损失，更会引起显著的DNA损伤和细胞周期G0/G1期停滞。DNA损伤是潜在的致癌风险因素，这对需要长期回输或植入的细胞治疗产品的安全性提出了重要警示。
2. DMSO残留的关键作用：研究明确区分了冻融物理过程与化学毒性的不同贡献。冻存介质中残留的DMSO是导致解冻后细胞持续遭受严重DNA损伤的主要因素。去除DMSO能大幅减轻DNA损伤，但无法完全避免细胞周期初期的停滞。
3. 氧化应激机制：冻存过程（包括CPA添加和温度变化）会剧烈上调细胞内ROS水平，这可能是诱发后续一系列损害（凋亡、DNA损伤、周期停滞）的上游机制之一。
4. 功能性损害：hBMSCs的核心治疗功能——多向分化潜能和体内迁移/归巢能力，在冻存后受到显著削弱。这种功能损害与DMSO残留浓度密切相关，高浓度残留（2%）可致功能几近丧失。
5. 临床操作启示：研究结果支持在临床移植前尽可能去除DMSO的操作，尽管这会增加成本、时间和细胞损失。更重要的是，它凸显了开发“即用型”（ready-to-use）、无需洗涤且无DMSO或使用更低毒性的新型冷冻保护剂的冻存方案的紧迫性，以满足细胞疗法规模化、安全化应用的需求。

研究亮点与创新

1. 研究视角全面系统：本研究并非孤立地考察细胞活力或单一功能，而是构建了一个从细胞生存（活力、凋亡）、基因组稳定性（DNA损伤、细胞周期）、氧化应激（ROS）到核心治疗功能（分化、迁移）的完整评估体系，全面揭示了DMSO冻存的综合生物学效应。
2. 精细模拟临床场景：实验设计巧妙地区分了“冻融后去除DMSO”和“含DMSO残留培养”两种情况，并设置了不同DMSO残留浓度（2% vs 0.5%）的功能学实验。这种设计直接回应了临床实践中面临的实际问题，使研究结论具有更强的现实指导意义。
3. 机制探索深入：通过检测ROS水平，将冻存损伤与氧化应激这一经典病理生理机制联系起来，为理解DMSO和冻融过程造成损害的机理提供了线索。同时，通过F-actin检测将迁移能力下降与细胞骨架改变相关联，增加了结果的解释深度。
4. 强调遗传毒性风险：将DNA完整性作为核心安全指标进行重点评估，并采用γH2AX免疫荧光这种敏感且特异的检测方法，突出了对细胞治疗产品潜在长期安全风险的关注，提升了研究的预警价值。

这项研究为细胞治疗领域，尤其是基于MSCs的疗法，提供了关于现行标准冻存方案（DMSO）安全性与功能影响的重要实证数据。它强烈呼吁产业界和学术界共同努力，加快研发更安全、高效、无需有毒化学保护剂的下一代细胞低温保存技术，以保障细胞治疗产品的最终疗效与患者安全。