关于调控带电分子分布与积累以提升细胞内递送效率的研究报告
本研究由Xiao-Nan Tao（复旦大学信息科学与技术学院）、Hao-Tian Liu（复旦大学工程与应用技术研究院）、Xiao-Wei Xiang（西湖大学生命科学学院/西湖实验室，通讯作者）、Cai-Hui Zhu（复旦大学信息科学与技术学院）、Jian Qiu（复旦大学信息科学与技术学院）、Hui Zhao（复旦大学信息科学与技术学院）以及Ke-Fu Liu（复旦大学信息科学与技术学院，通讯作者）共同完成。研究成果以题为“Regulating the Distribution and Accumulation of Charged Molecules by Progressive Electroporation for Improved Intracellular Delivery”的论文形式，发表于期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》（2024年，第16卷，第36063-36076页）。
一、 研究背景与目的
该研究属于生物医学工程、细胞生物学与生物物理学的交叉领域，聚焦于细胞内递送（intracellular delivery）这一关键技术。细胞膜作为选择性屏障，在保护细胞内部环境的同时，也阻碍了外源性分子（如药物、基因、探针等）的进入。电穿孔（electroporation）是一种广泛应用的非病毒物理递送方法，其原理是利用高强度、短时程的脉冲电场在细胞膜上瞬时形成亲水性孔道，允许原本无法穿透膜的分子进入细胞。传统电穿孔技术极大地促进了跨膜运输，但其研究重点多集中于如何更有效地“打开”细胞膜（例如通过微结构、微电极、表面修饰等手段），而往往忽视了分子在穿过膜之后的运动过程。在拥挤、高粘度的细胞质中，分子（尤其是带电分子）的扩散受限，可能无法有效抵达靶点（如细胞核），并可能在途中被降解或失活（例如化疗药物顺铂可能被胞质中的谷胱甘肽灭活）。这导致在实际应用中，为了达到预期的细胞内有效浓度，常常需要施加高剂量的外部分子，这不仅成本高昂，还可能带来严重的毒副作用。
因此，本研究旨在解决细胞内递送中的一个关键瓶颈：如何调控带电分子在进入细胞后的运动，以提高其递送效率、扩大其胞内分布并增加其在靶点区域的积累，从而降低所需的外源分子剂量。 研究者提出了一种名为“渐进式电穿孔”（Progressive Electroporation, PEP）的新策略。其核心思想是：利用经过调制的电场序列，在完成初始膜穿孔后，继续对已进入细胞内的带电分子施加一个温和、持久的电泳力，引导其向特定区域运动，从而优化整个递送过程。
二、 详细研究流程与方法
本研究采用了数值模拟与实验验证相结合的系统性方法，研究流程环环相扣，逻辑严谨。
1. 研究模型与对象： * 细胞模型： 数值模拟中建立了一个简化的二维双壳（细胞质与细胞核）细胞模型，直径设定为30 μm，模拟Hela细胞。实验主要使用人宫颈癌细胞系（Hela细胞）。 * 递送分子： 研究使用了三种不同大小和电荷的分子作为模型： * 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）： 带两个正电荷的荧光染料（分子量~0.64 kDa），用于参数优化、递送效率比较和动态过程观测。PI与核酸结合后发出强荧光，便于量化。 * 博来霉素（Bleomycin）： 带一个正电荷的化疗药物（分子量~1.5 kDa），几乎不能穿透完整细胞膜。 * 顺铂（Cisplatin）： 带两个正电荷的化疗药物（分子量~0.3 kDa），具有有限的膜渗透性。 * 电场参数与PEP策略： * 高压短脉冲（High-voltage Short-duration Pulses, HSPs）： 用于初始膜电穿孔。典型参数为：场强600-1400 V/cm，脉宽100 μs，频率1 Hz，8个脉冲。 * 低压长脉冲（Low-voltage Long-duration Pulse, LLP）： 用于在膜孔存在期间，对已进入细胞的带电分子施加电泳力。典型参数为：场强25-125 V/cm，脉宽100 ms。 * 渐进式电穿孔（PEP）： 将HSPs与LLP以特定时序组合。本研究主要测试了三种组合方式：LLP-HSPs（先LLP后HSPs）、HSPs-LLP（先HSPs后LLP）、LLP-HSPs-LLP（前后各加一个LLP）。研究结果表明，HSPs-LLP模式效果最佳。
2. 实验流程与步骤：
步骤一：电场参数优化与PEP有效性验证 * 目的： 在保证细胞高存活率（可逆电穿孔）的前提下，确定最佳的HSPs和LLP参数，并比较不同脉冲组合模式对递送效率的影响。 * 方法： * 细胞存活与电穿孔效率评估： 将Hela细胞悬浮液与PI混合，置于平行电极间。施加不同场强的HSPs，通过计算表现出PI非选择性进入（即膜通透性持续丧失）的细胞比例，评估细胞存活率。同时，通过PI荧光强度初步评估电穿孔效率。 * 细胞毒性测试（MTT法）： 在电刺激后24小时和48小时，检测单独HSPs、单独LLP以及不同组合方式（HSPs-LLP等）对细胞活力的影响，以确保所选参数安全。 * 递送效率定量比较： 使用优化后的参数（最终选定HSPs: 1000 V/cm, 100 μs, 1 Hz, 8脉冲；LLP: 75 V/cm, 100 ms），比较不同脉冲组合模式（HSPs单独、LLP-HSPs、HSPs-LLP、LLP-HSPs-LLP）下，细胞内PI的荧光强度（代表浓度）。 * 膜孔形态学观察（扫描电镜SEM）： 对经HSPs或HSPs-LLP处理后的细胞进行快速固定，通过扫描电镜观察并量化膜上电穿孔孔洞的大小和面积比例，以确认LLP的加入是否改变了初始穿孔的程度。 * 关键技术与设备： 使用自制的电脉冲发生器输出可编程的复杂脉冲序列；使用转盘共聚焦显微镜（Dragonfly）进行荧光成像；使用扫描电镜观察超微结构。
步骤二：PEP促进分子分布与积累的机制探究 * 目的： 从理论和实验上阐明PEP（特别是HSPs-LLP模式）如何增强带电分子的细胞内分布和积累。 * 方法： * 数值模拟： 使用COMSOL Multiphysics 5.4软件建立有限元模型。模型耦合了描述电穿孔动力学的常微分方程模块和描述溶质运输的稀释物质传递模块。通过求解Nernst-Planck方程（包含扩散项和电泳项），模拟PI分子在HSPs和HSPs-LLP作用下的跨膜运输及胞内时空分布。计算并比较了分子的扩散系数和电泳迁移系数。 * 动态递送过程观测： 使用共聚焦显微镜进行时间序列成像，实时追踪PI分子进入细胞及在胞内运动的动态过程。计算荧光强度的平均增加速率，并构建三维荧光分布图，直观展示HSPs-LLP与单独HSPs在分子分布不对称性和积累量上的差异。 * 关键分析： 模拟和实验均聚焦于LLP阶段对分子运动的调控作用。理论计算表明，对于带电分子，电泳迁移系数比扩散系数高约两个数量级，因此在膜孔开放期间，电场驱动的电泳是主导分子运动的关键机制。
步骤三：PEP增强化疗药物疗效的验证 * 目的： 将PEP策略应用于实际治疗场景，验证其是否能提高带电化疗药物（博来霉素和顺铂）的疗效，从而降低所需药物剂量。 * 方法： * 电化学治疗（Electrochemotherapy）与细胞毒性测定： 将Hela细胞与不同浓度的博来霉素或顺铂混合，施加优化后的电脉冲（单独HSPs或HSPs-LLP）。24小时后，通过MTT法测定细胞活力，计算半数抑制浓度（IC50），比较不同处理组所需的药物剂量。 * 早期细胞凋亡与活性氧（ROS）检测： 在药物处理（使用基于HSPs的IC50浓度）后12小时，使用流式细胞术通过Annexin V/PI双染检测早期和晚期凋亡细胞比例。同时，使用荧光探针检测细胞内ROS水平，因为ROS积累是许多化疗药物（包括博来霉素和顺铂）早期诱导凋亡的关键信号。 * 晚期细胞凋亡与核碎裂观察： 在药物处理24小时后，再次通过流式细胞术分析凋亡，并通过荧光显微镜观察典型的晚期凋亡特征——核碎裂（Nuclear fragmentation）现象。 * 细胞周期分析： 通过流式细胞术PI染色分析不同处理对细胞周期分布的影响，探究药物疗效增强的细胞周期阻滞机制。
步骤四：PEP安全性及分子机制初探（转录组学分析） * 目的： 在基因组层面评估PEP策略本身的安全性，并探究PEP增强博来霉素疗效所涉及的潜在信号通路。 * 方法： * 转录组测序（RNA-Seq）： 设置四组样品：对照组（无处理）、PEP单独处理组（HSPs-LLP）、博来霉素单独处理组、PEP联合博来霉素处理组。在处理后12小时收取细胞，提取总RNA进行高通量测序。 * 生物信息学分析： 对测序数据进行质量控制、比对、基因表达定量和差异表达分析。通过基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，找出显著上调或下调的基因集及其相关的生物学过程和信号通路。使用主成分分析（PCA）评估各组样本的整体基因表达差异。
三、 主要研究结果
参数优化与PEP有效性： 研究确定了可逆电穿孔的最佳HSPs场强为1000 V/cm，LLP场强为75 V/cm。在保证细胞高存活率（>90%）的前提下，HSPs-LLP组合模式能最有效地提高PI的细胞内递送量，比单独使用HSPs提高约1.4倍。扫描电镜结果显示，HSPs-LLP与单独HSPs产生的膜孔大小和面积比例无显著差异，证明递送效率的提升并非源于更大的穿孔，而是LLP提供的额外电泳驱动力所致。
PEP促进分子分布与积累的机制： 数值模拟清晰显示，在HSPs打开膜孔后，施加LLP能显著加速带电分子（PI）的进入，并使其在细胞内（特别是靠近阳极侧的细胞质区域）分布更广、积累更多。时间序列共聚焦成像实验证实了这一结果：HSPs-LLP处理组的PI荧光强度增加速率更快，最终累积量更高，且呈现出更明显的阳极侧不对称分布。这直接验证了PEP策略的核心优势：在膜孔开放的时间窗口内，利用温和的LLP电场持续驱动已进入细胞的带电分子，克服胞质阻力，实现更快速、更广泛的胞内分布和靶向积累。
PEP增强化疗药物疗效：
PEP的安全性及分子通路激活： 转录组测序分析表明，单独施加优化后的PEP（HSPs-LLP）与未处理对照组在基因表达谱上高度相似，聚类分析中紧密聚集，说明PEP本身对细胞的转录组干扰极小，具有良好的生物安全性。然而，PEP联合博来霉素处理与单独博来霉素处理相比，则引发了广泛的基因表达差异（上调770个，下调919个）。通路富集分析揭示，PEP联合处理提前并显著激活了多条与细胞凋亡相关的信号通路，如PI3K-Akt、MAPK、FoxO、NF-κB和p53信号通路。此外，还涉及细胞骨架重组、细胞连接以及IL-17（免疫相关）等通路。这从分子层面解释了PEP如何通过促进药物积累，进而强力触发下游的细胞死亡程序。
四、 研究结论与价值
本研究成功提出并验证了一种名为“渐进式电穿孔”（PEP）的新型细胞内递送策略。该策略的核心创新在于将电穿孔过程从单纯的“开孔”拓展到对入胞后分子运动的“引导”。通过将高压短脉冲（HSPs）与低压长脉冲（LLP）顺序组合，PEP首先高效地打开细胞膜通道，随后利用温和的长脉冲电场对带电分子施加持续的电泳力，驱动其在胞质中更快速、更广泛地分布并积累，从而显著提高了递送效率。
本研究的科学价值在于： 1. 深化了对电穿孔递送过程的理解： 强调了跨膜后分子运动调控的重要性，为电穿孔理论提供了新的维度。 2. 提供了一种普适性的效率提升策略： PEP策略不依赖于特定的纳米材料或复杂的细胞工程，仅通过优化电场参数即可实现，具有方法简单、成本低、易于推广的优点。 3. 揭示了电场调控分子运动的潜力： 证明了外部电场不仅能破坏膜屏障，还能在亚细胞尺度上精确操控分子的运输轨迹，为基于物理场的精准递送奠定了基础。
其应用价值显著： 1. 降低药物剂量，减少副作用： 在电化学治疗（Electrochemotherapy）等场景中，PEP有望在保持甚至提高疗效的同时，将化疗药物（如博来霉素、顺铂）的所需剂量降低10-40%，从而减轻患者的全身毒副作用。 2. 提升基因转染与细胞工程效率： 该策略同样适用于其他带电大分子（如DNA、RNA、蛋白质）的递送，可能加速基因表达或提高基因编辑效率。 3. 为敏感细胞监测提供新工具： 更高效、更低剂量的荧光探针递送，有助于实现更精准、更低扰动的活细胞动态观测。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
作者在讨论中指出，PEP策略的增强效果与分子特性（如电荷、大小）相关。对于斯托克斯半径更大、扩散系数更小的博来霉素，电泳辅助（LLP）的作用尤为关键。这提示我们，未来可以针对不同特性的递送分子，进一步个性化地优化PEP的脉冲参数（如LLP的场强、时长、波形），以实现最优化的递送效果。此外，作者展望了将这种电场操控分子运动的方法与表面电荷修饰等化学方法相结合，有望在细胞工程、敏感细胞监测等生物医学应用领域实现更高效、更智能的递送平台。