糖尿病肾病（diabetic kidney disease, DKD）是糖尿病最常见且最严重的并发症之一，也是导致终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的主要原因。全球范围内，慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）患者已超过8.4亿，其中约40%的2型糖尿病患者和30%的1型糖尿病患者会发展为DKD。目前，临床上缺乏安全有效的DKD预防策略，现有治疗手段主要集中于控制血糖、血压及血脂，难以从根本上阻断疾病进展。因此，寻找新的治疗靶点和干预药物具有重要的科学意义和临床价值。
铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的、由脂质过氧化（lipid peroxidation, LPO）驱动的程序性细胞死亡形式，近年来被证实参与多种肾脏疾病的发病机制，包括急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）和DKD。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）是调控抗氧化反应的关键转录因子，能够启动内源性抗氧化系统，在肾脏氧化应激防护中发挥核心作用。此外，Nrf2还参与调节细胞铁代谢，控制细胞内铁水平，并促进谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）的合成，从而抑制铁死亡。已有研究表明，Nrf2信号通路的激活可以减轻糖尿病肾病中的氧化损伤和铁死亡，但其上游调控机制及药物干预策略仍不明确。
小檗碱（berberine, BBR）是中药黄连的主要活性成分，具有降血糖、降血脂、抗炎和抗氧化等多种药理作用。既往研究显示BBR能够抑制DKD小鼠肾小管上皮细胞的上皮间充质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT），但其是否通过调控Nrf2信号通路抑制铁死亡从而延缓DKD进展，尚缺乏直接证据。基于此，本研究旨在通过体内外实验系统验证BBR对DKD的预防作用，并阐明其通过靶向激活Nrf2通路抑制氧化应激和铁死亡的具体分子机制。
本研究由山东第二医科大学附属中医医院、北京中医药大学等单位的研究团队完成，通讯作者为赵宗江，研究成果发表于 Phytotherapy Research 期刊（2025年，第39卷，5604–5616页）。研究分为体内实验和体外实验两大部分，并结合分子对接和表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）技术进行靶点验证。
体内实验采用高脂高糖饮食联合链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的DKD大鼠模型。共40只雄性SPF级SD大鼠（6–8周龄，160–220 g）随机分为对照组（n=10）和DKD模型组（n=30）。模型组大鼠先接受8周高糖高脂饲料喂养，随后腹腔注射STZ（35 mg/kg）诱导糖尿病，对照组注射等量柠檬酸钠缓冲液。3天后检测尾静脉血糖，血糖>16.7 mmol/L且4周后24小时尿蛋白>30 mg并伴有大量蛋白尿（++++）者视为造模成功。造模过程中死亡6只，最终24只大鼠随机分为DKD组、厄贝沙坦（irbesartan, IRB，25 mg/kg/d）组和BBR组（200 mg/kg/d），每组8只，持续灌胃16周。实验期间每4周称量体重，每日监测一般状况。干预结束后麻醉处死大鼠，采集血清和肾组织进行生化指标检测、组织病理学检查、透射电镜（TEM）观察、免疫组化（IHC）和蛋白印迹（Western blot）分析。
体外实验采用人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）建立晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）诱导的铁死亡模型。HK-2细胞在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养，以AGEs（200 μg/mL）刺激48小时诱导细胞损伤，同时给予不同浓度BBR（25、50、100 μM）干预。通过CCK-8法检测细胞活力，倒置显微镜观察细胞形态，TEM观察线粒体超微结构。为进一步验证Nrf2在BBR保护机制中的作用，采用siRNA技术沉默HK-2细胞中Nrf2的表达，再观察BBR对下游蛋白表达的影响。
靶点验证部分，首先通过分子对接技术预测BBR与Nrf2、HO-1、GPX4蛋白的结合能力。从PubChem下载BBR和Fer-1的2D结构，使用Chem3D软件优化结构，从PDB数据库选取目标蛋白晶体结构，利用AutoDock Tools进行虚拟对接，计算结合自由能。随后利用Biacore T200仪器进行SPR实验，将人Nrf2蛋白偶联至CM5传感芯片上，以不同浓度BBR（0.3125–10 μM）进行结合动力学分析，计算平衡解离常数（KD）、结合速率常数（ka）和解离速率常数（kd）。
BBR改善DKD大鼠的肾功能和代谢指标：与DKD模型组相比，BBR组大鼠从治疗第8周起体重逐渐回升，24小时尿蛋白水平显著降低（p<0.01），血清肌酐（serum creatinine, SCr）和尿素（urea）水平明显下降（p<0.05, p<0.01），血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL）浓度也显著降低（p<0.05），提示BBR可有效改善DKD大鼠的肾功能和脂代谢紊乱。
BBR抑制氧化应激和铁沉积：BBR治疗显著降低DKD大鼠血清活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平（p<0.05），升高一氧化氮（NO）和超氧化物歧化酶（SOD）水平（p<0.05）。肾组织中脂质过氧化物（LPO）、丙二醛（MDA）和铁离子含量在DKD组显著升高，BBR干预后均明显下降（p<0.05），提示BBR可减轻肾脏氧化损伤和铁过载。
BBR改善肾组织病理损伤：H&E染色显示DKD大鼠肾小球系膜基质扩张、基底膜增厚、炎性细胞浸润及肾小管空泡变性，BBR干预后上述病变明显减轻。Mallory染色显示BBR减少胶原纤维沉积和肾间质纤维化。TEM观察显示BBR改善了DKD大鼠肾小球足细胞损伤和基底膜增厚。普鲁士蓝染色证实BBR显著减少肾组织铁沉积。
BBR调控Nrf2通路相关蛋白表达：免疫组化和Western blot结果显示，DKD大鼠肾组织中GPX4表达显著降低，而Nrf2、ACSL4和HO-1表达升高。BBR干预后，Nrf2、GPX4和HO-1蛋白水平进一步升高，ACSL4表达降低，且效果优于IRB组。
分子对接与SPR验证BBR与Nrf2的结合：分子对接结果显示BBR与Nrf2、HO-1、GPX4的结合自由能分别为−8.98、−9.79和−9.45 kcal/mol，均低于−5.0 kcal/mol，且结合能力强于Fer-1。SPR实验测得BBR与Nrf2的解离平衡常数KD为5.58×10⁻⁶ M，结合速率常数ka为6.45×10⁴ (1/Ms)，解离速率常数kd为3.60×10⁻¹ (1/s)，表现为“慢结合/快解离”的动力学特征，证实BBR对Nrf2具有直接且较强的亲和力。
BBR减轻AGEs诱导的HK-2细胞铁死亡：CCK-8实验显示AGEs刺激48小时可显著降低HK-2细胞活力，BBR（25、50、100 μM）干预可剂量依赖性地恢复细胞活力。形态学观察显示AGEs导致细胞变圆、体积缩小、间隙增大、贴壁性下降，BBR处理可改善细胞形态和贴壁能力。TEM观察显示AGEs引起线粒体膜密度增高、嵴断裂或消失、膜破裂，BBR处理后线粒体结构明显改善。免疫荧光和Western blot结果显示BBR显著升高AGEs诱导的HK-2细胞中GPX4表达，降低ACSL4表达，并进一步升高Nrf2和HO-1蛋白水平。siRNA沉默Nrf2后，BBR对HO-1和GPX4蛋白的上调作用被显著削弱，直接证明了Nrf2信号通路在BBR抗铁死亡保护效应中的因果作用。
本研究首次系统证明小檗碱可通过直接结合并激活Nrf2信号通路，启动内源性抗氧化系统，抑制AGEs诱导的肾小管上皮细胞铁死亡，从而延缓DKD的疾病进展。该研究为BBR防治DKD提供了新的分子靶点和科学依据，同时也为Nrf2作为DKD治疗靶点的可行性提供了实验支持。在临床转化层面，BBR作为一种安全性良好的天然活性成分，具有潜在的药物开发价值，尤其适用于需要长期干预的慢性代谢性肾脏疾病。研究的创新之处在于：首次通过SPR技术验证了BBR与Nrf2的直接结合；系统整合了体内DKD模型、体外AGEs诱导的铁死亡模型以及分子对接和SPR靶点验证手段，形成了从表型到机制、从整体到分子的完整证据链。