本文是一篇详细的方法学论文（Protocol），标题为《基于纤维蛋白的内皮细胞-心肌细胞共培养微流控装置实验方案》（Protocol for fibrin-based endothelial-cardiomyocyte co-culture in a microfluidic device），发表于期刊 STAR Protocols，出版时间为2026年6月19日。该方案由 Utrecht University（乌得勒支大学）University Medical Center Utrecht（乌得勒支大学医学中心）Regenerative Medicine Center Utrecht 的 Talitha C.F. Spanjersberg 等人完成，通讯作者为 Frank G. van Steenbeek。研究团队来自荷兰多个研究机构，包括乌得勒支大学医学中心心脏科、兽医学院临床科学系以及阿姆斯特丹大学医学中心生理学系等。该文以开放获取形式发表，遵循 CC BY 许可协议。

该研究属于器官芯片（organ-on-a-chip）与心脏组织工程交叉领域。研究背景主要针对当前体外心血管模型在可及性、可重复性和长期培养稳定性方面的不足。传统的基于聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）的微流控装置常会吸附疏水性小分子和化合物，影响药物测试的可靠性。同时，许多心脏共培养模型依赖定制化微加工设备，操作复杂且通量有限。本研究的目标是建立一种血管化的心脏芯片模型，该模型将人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell, hiPSC）来源的心肌细胞与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）共同封装在添加了血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和抑肽酶（aprotinin）的纤维蛋白水凝胶中，用于体外模拟心肌组织中的微血管网络和心肌收缩功能。

该方案的核心工作流程可分为以下几个步骤。首先，在细胞准备阶段，研究者解冻并扩增 HUVECs 和 hiPSC 来源心肌细胞。HUVECs 使用0.1%明胶包被培养瓶，传代次数不超过第7代，以避免内皮细胞血管内皮生长因子受体信号改变；hiPSC 来源心肌细胞则使用 Matrigel 包被，解冻后在恢复培养基中培养24小时，再换为心肌细胞培养基。两种细胞均在37°C、5% CO₂条件下培养，并在达到合适密度后用于共培养。第二步，在纤维蛋白水凝胶配制阶段，研究者将两种细胞以1:1比例混合，推荐终浓度为每毫升6.0–15.0×10⁶个活细胞。细胞悬液中加入终浓度2 U/mL的凝血酶（thrombin）和0.1 μg/mL的 VEGF165。随后将9 μL细胞悬液与等体积5 mg/mL纤维蛋白原混合，快速轻柔吹打后立即吸取8.5 μL混合液注入微流控芯片中央凝胶通道。芯片侧通道预先用低排量迷你鲁尔塞封闭，注入后置于37°C孵育10分钟使纤维蛋白聚合。第三步为培养维持。在加载凝胶后，侧通道内加入共培养恢复培养基（EGM-2与心肌细胞再接种培养基1:1混合），次日更换为共培养培养基（EGM-2与心肌细胞培养基1:1混合，添加25 ng/mL VEGF和抑肽酶）。若采用静态储液池，每日至少更换两次培养基；若使用灌注泵，则以2 μL/min的流速进行单向灌流，避免在凝胶中产生压力差。第四步为免疫荧光染色。培养物在芯片内直接进行固定、透化和抗体孵育。使用4%多聚甲醛固定15分钟，随后用含5%牛血清白蛋白和0.3% Triton X-100的透化封闭液处理60分钟。一抗使用抗α-辅肌动蛋白2（alpha-actinin-2, ACTN2）单克隆抗体，以1:200稀释后在4°C孵育24小时；二抗使用 Alexa Fluor 568 标记的驴抗小鼠 IgG，以1:400稀释后4°C孵育48小时。最后用 DAPI 复染细胞核。整个染色过程在芯片内完成，无需切片或包埋。第五步为定量分析。血管网络通过 AngioTool 2.0 软件对荧光图像进行分割，提取血管面积、总血管长度、平均血管长度、平均血管直径、连接点数量和分支密度等参数。心肌细胞收缩则通过拍摄至少60帧/秒的明场视频，使用 ImageJ 插件 MuscleMotion 进行运动分析，提取收缩幅度、达峰时间、舒张时间、瞬时持续时间以及搏动频率等指标。

该方案获得的主要结果包括以下几个方面。首先，在不同初始细胞密度下，内皮细胞均能在纤维蛋白凝胶中形成相互连接的血管网络。实验显示，当心肌细胞和内皮细胞以每毫升7.5×10⁶个细胞接种时，培养至第3天即形成连续网络；在更低或更高密度条件下也可形成网络，但高密度条件下长期培养可能因营养扩散受限而影响稳定性。其次，VEGF 和抑肽酶的添加对血管网络的长期稳定性至关重要。在静态液滴培养中，添加这两个因子的培养物在第7、14和21天均保持连续血管网络，而未添加的对照组则出现血管网络的进行性退化。第三，共聚焦 z 轴堆叠成像证实了血管结构中空腔（lumen）的存在，表明这些血管超越了简单的内皮细胞索状结构，达到了管腔化程度。第四，心肌细胞在共培养中保持完整的肌节结构，α-辅肌动蛋白染色显示肌节排列有序，且与邻近血管之间存在空间上的相互作用。第五，心肌细胞自发搏动通常在培养第一周内观察到，之后搏动活动逐渐减弱，这与 hiPSC 来源心肌细胞向更成熟表型转变的报道一致。第六，免疫荧光染色可在完整芯片内实现三维可视化，无需透明化或切片处理。在收缩功能定量方面，MuscleMotion 分析显示，在添加 VEGF 和抑肽酶条件下，心肌细胞收缩参数与对照组大部分重叠，说明该因子组合并未显著损害心肌细胞的基础收缩功能。

该方案的结论是，通过将 HUVECs 和 hiPSC 来源心肌细胞共封装在添加 VEGF 和抑肽酶的纤维蛋白水凝胶中，可以在商品化、无 PDMS 的微流控芯片内建立稳定的血管化心脏芯片模型。该模型支持内皮细胞自组装形成具有管腔的微血管网络，并在至少三周内保持网络稳定性。同时，心肌细胞在共培养中维持肌节结构和收缩活性。该方案的主要意义在于提供了一个不依赖定制微加工设备的开放可及平台，降低了器官芯片研究的技术门槛，提高了实验通量和可重复性。该模型可应用于心脏疾病建模和药物反应研究，尤其适用于需要观察血管-心肌相互作用的场景。此外，该方案还讨论了当前模型的局限性，包括 HUVECs 并非心脏特异性内皮细胞、缺乏周细胞和成纤维细胞支撑、尚未进行功能性灌注验证、长期灌流中气泡积累等问题，为后续优化提供了明确方向。