本研究由Todd C. Sutherland、Yi-Tao Long、Radu-Ioan Stefureac等作者团队完成，作者单位包括加拿大萨斯喀彻温大学化学系与生物化学系，成果发表于《Nano Letters》2004年第4卷第7期（2004年6月2日在线发表）。以下是针对这项单分子肽结构分析技术的学术报告：

研究背景与目标

该研究属于纳米孔单分子检测技术领域，核心科学问题是如何利用生物纳米孔实现肽链二级/三级结构的单分子分辨。传统光谱技术（如圆二色谱CD或核磁共振NMR）只能获得分子群体的平均结构信息，而细菌溶血素（α-hemolysin, α-HL）纳米孔因其15 Å的限域孔径和稳定单通道电导特性，为单分子结构分析提供了新思路。研究团队旨在通过设计胶原样重复序列（Gly-Pro-Pro）n的模型肽，验证纳米孔技术区分单链、双链及三螺旋肽构象的能力。

研究方法与流程

1. 实验设计与材料制备
- 肽链合成：设计三种含铁羰基（ferrocene, Fc）修饰的胶原样肽（P1: n=1；P2: n=2；P3: n=3），通过固相合成法制备，其结构经质谱和CD光谱验证（文献23）。
- 纳米孔搭建：使用α-HL七聚体在平面脂质双分子层形成纳米孔，缓冲液为18 MΩ超纯水，实验温度控制在22±1℃。

2. 单分子检测系统
- 电信号采集：施加100 mV跨膜电压，通过Axon Instruments膜片钳系统记录电流信号（采样频率10 kHz）。当肽链穿过纳米孔时，产生特征性电流阻断（iblock）和持续时间（tblock）。
- 氧化调控：对P3进行电化学氧化（Fc→Fc+），研究电荷效应对转运动力学的影响。

3. 数据分析方法
- 二维等高线图分析：采用ClampFit 9.0和Origin 7.0软件，将电流阻断（bin宽度0.5 pA）与持续时间（bin宽度0.025 ms）构建二维矩阵，通过高斯函数拟合电流分布，双指数函数拟合时间分布。
- 扩散系数计算：基于棒状模型假设，通过阻断电流反推肽链直径，进而计算有效扩散系数。

关键结果与发现

1. 构象特异性信号特征
- P1（单体）：主要呈现两个群体——线性单链（iblock=-45 pA）和U型折叠（iblock=-52.3 pA，τ2=408 μs），CD光谱显示无规卷曲构象。
- P2（二聚体）：主导群体为线性双链（iblock=-57.6 pA，τ2=547 μs），其阻断电流增大与双链直径增加一致。
- P3（三螺旋）：显著出现胶原三螺旋特征信号（iblock=-75.4 pA，τ2=591 μs），与晶体结构预测的12 Å直径吻合。氧化后P3（P3ox）因正电荷排斥导致阻断时间延长至649 μs。

2. 技术对比优势
CD光谱仅能检测P3的整体螺旋倾向性，而纳米孔分析揭示了P2中未被CD识别的部分螺旋中间态（群体3），证明单分子检测对构象异质性的分辨能力。

3. 扩展应用验证
测试RNA聚合酶II C端重复肽（CT7N，37个氨基酸）时，发现其通过多重折叠穿越纳米孔（iblock≈-75 pA，tblock ms），为研究无序肽链的动态折叠提供了新范式。

结论与价值

科学意义：
1. 首次证明纳米孔技术可区分肽链的二级/三级结构差异，弥补了传统光谱技术的局限性。
2. 建立了基于iblock-tblock二维参数的构象分类标准，为单分子蛋白质折叠动力学研究奠定方法学基础。

应用前景：
- 拓展至α-螺旋/β-折叠分析，可能推动蛋白质测序技术发展。
- 通过化学修饰调控肽链电荷，可实现对转运动力学的精确操控。

研究亮点

1. 创新方法：开发二维等高图分析法，避免一维分箱导致的参数耦合误差。
   
2. 模型设计：利用(Gly-Pro-Pro)n序列的构象可调性，系统验证技术灵敏度。
   
3. 跨学科价值：融合生物纳米孔工程、单分子电化学与肽链构象理论，推动纳米孔技术从核酸向蛋白质分析领域延伸。
   

补充发现

研究发现中性肽穿越速度（0.06 Å/μs）比多核苷酸慢一个数量级，提示纳米孔内摩擦阻力对生物大分子转运的显著影响，这一现象为后续纳米孔器件设计提供了重要参数。

（注：文中α-hemolysin、ferrocene等专业术语首次出现时保留英文原名，后续使用中文译名”α-溶血素”、”铁羰基”）