皮质微环境驱动骨愈合早期免疫组织形成并调控早期破骨细胞生成

主要作者与机构：本文通讯作者为Georg Duda，其所属机构为Charité – Universitätsmedizin Berlin（柏林夏里特医学院）。研究发表于 *Nature Communications*，文章编号为(2026) 17:9154，DOI为https://doi.org/10.1038/s41467-026-77196-7，投稿时间为2025年8月26日，接收时间为2026年8月18日。

学术背景：骨折愈合是一个复杂的、精密调控的再生过程，依赖免疫细胞与基质细胞（stromal cells）在空间和时间上的协调相互作用。骨折后的早期阶段需要及时清除坏死组织和骨碎片，该任务主要由巨噬细胞（macrophages）和破骨细胞（osteoclasts）承担。然而，破骨细胞如何在骨折部位出现、其分化受何种局部微环境信号调控，目前在单细胞和空间分辨率层面仍不清楚。经典理论认为破骨细胞主要参与愈合晚期的骨重塑阶段，但组织学证据显示破骨细胞在骨内膜和皮质骨表面出现的时间远早于预期。此外，衰老会显著影响骨折愈合：老年个体愈合延迟与非适应性免疫应答改变及破骨细胞活性变化相关，但衰老如何影响骨折相关巨噬细胞和破骨细胞分化轨迹仍不明确。本研究旨在利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）和多表位配体图谱（multi-epitope ligand cartography, MELC）技术，绘制年轻（12周龄）和老年（52周龄）雌性小鼠骨折愈合起始阶段不同细胞区室的空间组织图谱，鉴定参与早期破骨细胞生成的巨噬细胞亚群及其调控微环境信号，并揭示衰老对这一过程的干扰机制。

详细研究流程：研究采用标准化小鼠股骨截骨模型，在左股骨制造0.7 mm截骨间隙并用单侧外固定器稳定，在术后第3天和第7天收集骨折组织，以同龄未受伤小鼠的完整股骨及对侧未受伤股骨作为对照。研究主要分为四个关键程序。第一，组织学与破骨细胞活性分析：对骨折组织进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，定量TRAP阳性面积以评估破骨细胞活性的时间和空间分布。第二，单细胞RNA测序与细胞图谱构建：采用两步法分离骨髓和皮质骨细胞——先通过冲洗髓腔收集骨髓细胞，再对残余皮质骨碎片进行胶原酶和分散酶酶消化以获取皮质黏附细胞。共回收178,416个细胞，利用UMAP降维和Louvain聚类识别出16个细胞簇，包括3个中性粒细胞簇、造血干细胞、单核细胞祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、基质细胞等，并通过标志基因进行注释。第三，巨噬细胞谱系亚群分析与破骨细胞分化能力验证：将单核细胞祖细胞、单核细胞和巨噬细胞重新聚类为6个亚群，通过拟时间轨迹分析（pseudotime analysis）推断分化路径；进一步利用流式细胞分选分离CD14⁺F4/80^lo（对应骨折相关Spp1^hi巨噬细胞）和CD163^hiF4/80^hi巨噬细胞，在M-CSF和RANKL刺激下进行体外破骨细胞生成实验（osteoclastogenesis assays），比较不同亚群形成TRAP阳性多核破骨细胞的能力；同时使用TNFδARE/+小鼠（慢性TNF驱动炎症模型）评估炎症对破骨细胞分化潜能的影响。第四，空间定位与细胞通讯分析：利用12标记MELC面板在空间上验证巨噬细胞、中性粒细胞和基质细胞在皮质骨界面的富集；建立巨噬细胞亚群特异性标记面板（CD68、CD206、CD163）以区分单核细胞、Spp1^hi巨噬细胞和CD163^hi巨噬细胞在皮质骨50 µm范围内的空间分布；进行配体-受体分析以揭示中性粒细胞-3与Spp1^hi巨噬细胞之间的通讯网络；对基质细胞亚群（内皮细胞和前成骨细胞）进行基因模块评分，评估成骨、成软骨、成脂及破骨支持性信号（如Csf1、Tnfsf11、Cxcl12、Wnt5a）的表达水平。数据分析流程包括Seurat标准化与整合、Harmony批次校正、差异表达基因分析和KEGG通路富集分析。

主要研究结果：在组织学层面，年轻小鼠第7天TRAP阳性破骨细胞数量显著增加，主要集中在皮质骨表面和残留骨碎片周围，而老年小鼠该诱导反应明显减弱，表明早期破骨细胞活性在年轻小鼠中更活跃且该过程在衰老中受损。单细胞测序显示骨折诱导的免疫反应具有高度区室化特征：骨髓在第3天出现中性粒细胞祖细胞和单核细胞祖细胞的短暂扩增，而皮质骨在第3天出现巨噬细胞约30倍增加，中性粒细胞-3亚群随时间持续积累至第7天达到峰值。对侧未受伤股骨未观察到类似变化，证明这些免疫变化由局部损伤信号而非全身效应驱动。MELC空间分析证实CD68⁺CD45⁺巨噬细胞和Ly6G⁺CD45⁺中性粒细胞在术后第3天和第7天显著富集于皮质骨50 µm范围内。在巨噬细胞亚群层面，研究鉴定出骨折相关Spp1^hi巨噬细胞亚群，其高表达Adgre1、Spp1、Cd14、C3ar1和Mrc1，呈现出炎症-修复过渡状态。拟时间分析显示该亚群是分化轨迹的关键分支点：来自Ly6C^hi单核细胞的Spp1^hi巨噬细胞可分别向CD163^hi修复性巨噬细胞或破骨细胞分化。体外实验显示Spp1^hi巨噬细胞在M-CSF和RANKL刺激下能高效形成大的多核TRAP阳性破骨细胞，而CD163^hi巨噬细胞几乎不形成破骨细胞，证明前者具有显著的破骨细胞分化潜能。TNFδARE/+小鼠实验表明慢性炎症主要增加Spp1^hi巨噬细胞的丰度而不改变其每细胞分化能力。在时间动力学上，皮质骨中Spp1^hi巨噬细胞在第3天增加约75倍，随后破骨细胞数量进行性增加，提示皮质微环境支持局部原位破骨细胞生成。空间命运偏向分析进一步证实向破骨细胞的转变特异性发生于皮质骨区室，而向CD163^hi巨噬细胞的分化则偏向骨髓区室。转录组学分析显示Spp1^hi巨噬细胞在第3天表现为促炎和糖酵解特征，到第7天转变为氧化磷酸化和破骨细胞分化相关通路，且这些转录程序在老年小鼠中基本保留，提示衰老导致的破骨细胞生成受损更可能源于微环境信号改变而非细胞内在功能障碍。中性粒细胞-3与Spp1^hi巨噬细胞形成主导的细胞通讯轴，其中Cxcl2–Cxcr2和Spp1–Cd44信号在各时间点持续富集，而老年小鼠中Ccl4–Ccr5和Thbs1相关相互作用发生微妙改变。前成骨细胞在年轻小鼠中表达更高水平的Csf1、Tnfsf11、Cxcl12、Wnt5a和Il6等破骨支持性信号，尤其在骨折皮质组织中该差异更为显著，且年轻小鼠前成骨细胞表现出更高的祖细胞样程序和更低的成脂偏向。

结论与意义：本研究揭示早期破骨细胞生成并非仅由前体细胞身份决定，而是受到空间组织化微环境的严格调控。皮质骨微环境在骨折愈合早期作为固有免疫激活、组织碎片清除和破骨细胞生成的主要场所，而骨髓继续充当造血储备库。骨折相关Spp1^hi巨噬细胞被鉴定为一类皮质骨限制性过渡态细胞，其超越经典M1/M2极化范式，在中性粒细胞协同下形成预再生免疫模块，从愈合最初阶段启动重塑级联反应。衰老不废止破骨细胞分化的潜能，但改变或破坏了支持该过程的微环境信号。这项研究为组织背景如何塑造再生早期免疫功能提供了新的概念框架，并提示增强或模拟年轻基质细胞信号可能成为改善老年骨愈合的靶向策略。

研究亮点：第一，首次在单细胞和空间分辨率下同时绘制了骨折愈合极早期骨髓和皮质骨两个区室的免疫-基质细胞图谱，揭示了高度区室化的免疫应答组织方式。第二，鉴定出骨折相关Spp1^hi巨噬细胞作为处于炎症-修复过渡态的破骨细胞前体细胞群，并通过体外功能实验和空间命运偏向分析双重验证了其向破骨细胞分化的潜能和皮质骨区室偏好性。第三，阐明了“中性粒细胞–Spp1^hi巨噬细胞–前成骨细胞”三方协同组成的皮质骨破骨支持性微环境，强调了细胞间通讯在早期破骨细胞生成中的核心作用。第四，通过年轻与老年小鼠对比，提出衰老对骨折愈合的损害主要作用于微环境信号而非细胞内在分化程序，这一发现将研究焦点从细胞自主性缺陷转向微环境调控，为老年骨折愈合障碍的干预提供了新思路。此外，研究采用的骨髓冲洗-皮质酶消化两步分离法结合细胞哈希标记策略，为骨组织不同区室的单细胞比较分析提供了方法学参考。