针对生物药大规模冷冻中冷冻浓缩与温度分布的研究：一种新型缩小规模装置的性能评估
一、 研究团队、期刊与发表时间 本项研究的主要作者包括 Oliver Bluemel (慕尼黑大学药学与生物药学系)， Jakob W. Buecheler， Miguel A. Rodrigues (里斯本高等理工学院化学工程系)， Vitor Geraldes， Georg Hoelzl， Karoline Bechtold-Peters (诺华制药) 以及 Wolfgang Friess (慕尼黑大学药学与生物药学系)。 该研究于2020年发表在药学期刊 Pharmaceutical Research 上 (Pharm Res (2020) 37:179)。
二、 学术背景与研究目标 科学领域与背景知识： 本研究的核心科学领域是生物制药工艺开发，具体聚焦于蛋白质类药物（尤其是单克隆抗体，mAb）大批量原料药（Bulk Drug Substance）的冷冻储存工艺。 冷冻存储是延长生物大分子药物货架期、确保其稳定性的常用手段，但冷冻过程本身可能对蛋白质造成多重压力，其中宏观尺度上的冷冻浓缩 (Cryoconcentration) 是一个关键挑战。 在冷冻过程中，冰晶的生长会将溶质（蛋白质、缓冲盐等）排斥到未冻结的液体区域，导致这些区域浓度急剧升高，形成浓度梯度。 冷冻浓缩的程度受冷却速率、样品规模、容器尺寸和几何形状、以及溶液性质（如粘度）的显著影响。 缓慢冷冻通常会导致更严重的宏观冷冻浓缩。
研究动机与目标： 在工业化生产中，通常使用如2升PET瓶等大规模容器进行原料药冷冻。然而，在药物开发的早期阶段，可供用于工艺研究的物料通常非常有限。 因此，开发能够精确模拟大规模冷冻行为的缩小规模装置 (Scale-Down Device, SDD) 至关重要，以便在物料消耗最少的情况下，研究冷冻参数和处方组成对产品稳定性的影响。 在此之前，市场上缺乏能够有效模拟大规模瓶装冷冻的商业化SDD。 本研究旨在评估一种由SmartFreez公司开发的新型SDD的性能。 该SDD基于一种特殊设计的绝缘罩，用于改装125毫升的PET瓶，旨在模拟2升瓶的冷冻行为。 本研究的具体目标包括：1) 比较SDD与大规模2升瓶在冷冻过程中的三维温度分布；2) 评估SDD在预测大规模冷冻后单克隆抗体和组氨酸缓冲液浓度变化（即冷冻浓缩）方面的准确性；3) 探究初始单克隆抗体浓度（通过影响溶液粘度）对冷冻浓缩程度的影响。
三、 详细工作流程 本研究包含一个系统性的工作流程，涵盖装置开发、温度测绘、冷冻浓缩分析和粘度测量等多个环节。
1. 缩小规模装置的设计与开发： 本研究使用的SDD并非简单的几何缩小模型。其设计基于计算流体动力学 (Computational Fluid Dynamics, CFD) 模拟和实验优化。 研究团队建立了一个CFD数学模型，模拟了2升瓶在特定冷冻条件（-80°C CO2强制对流）下的热历史和流体行为。 该模型的关键创新在于引入了“应力时间”的概念，即每个约1 mm³的控制体积从冰晶成核到达到玻璃化转变温度所经历的时间。 在这段时间内，蛋白质分子暴露于冰界面、低温和高浓度环境中，被认为是潜在的降解风险期。 研究的目标是让SDD内部的“应力时间分布”与2升瓶的分布相匹配，而不是简单地匹配总冷冻时间。 通过CFD模拟优化，最终设计的SDD（如图2所示）由一个硬质聚乳酸支架和一个软质聚合物内衬组成。支架内腔装有相变液体（1%乙醇），用于绝缘125毫升瓶的大约两个壁面，从而改变其热传递路径，使其一个象限的冷冻行为模拟2升瓶四分之一区域的冷冻行为。
2. 温度测绘与冷冻过程表征： 为了评估SDD是否能重现大规模冷冻的热力学特征，研究团队在125毫升瓶、2升瓶以及装载了125毫升瓶的SDD中，于六个对应位置（如图3所示）布置了T型热电偶，进行三维温度测绘。 所有容器均灌装5 mg/mL的单克隆抗体溶液。 冷冻实验在一个强制对流空气冷冻箱中进行，程序设定为从20°C以最大速率冷却至-40°C并保持。 温度数据每分钟记录一次。 通过分析温度曲线，研究者定义了“有效冷冻时间”（从开始冷却到温度平台期结束的时间）和“过程时间”（从平衡后到达-38°C所需的时间），用以量化比较不同容器和装置的冷冻动力学。
3. 冷冻浓缩分析： 这是研究的核心实验部分，旨在量化冷冻后单克隆抗体和组氨酸的浓度分布。 实验比较了三个系统：独立的125毫升瓶、独立的2升瓶以及装载在SDD中的125毫升瓶。 所有系统均灌装5 mg/mL的单克隆抗体溶液，并采用与温度测绘相同的冷冻程序。 冷冻完全后，将冻结的样品块用带锯切割成体积近似相等的小块（125毫升瓶约3 mL/块，2升瓶约7 mL/块）。 将每小块样品解冻后，分别通过高效液相色谱法 (HPLC) 定量分析单克隆抗体和组氨酸的浓度。 浓度变化用“冷冻浓缩因子” (Cryoconcentration Factor, CF) 表示，定义为样品浓度与初始浓度的比值 (CF = Cx / C0)。 通过绘制三维浓度分布图，直观展示冷冻浓缩的空间异质性。
4. 初始蛋白质浓度对冷冻浓缩的影响： 为了探究溶液粘度这一关键物性参数的影响，研究额外配制了0.5 mg/mL和150 mg/mL两种不同初始浓度的单克隆抗体溶液，并在SDD中进行冷冻浓缩实验，方法与上述一致。 为了建立粘度与冷冻行为之间的关联，研究还进行了两项补充的流变学测量：a) 浓度依赖性粘度：在20°C下，测量单克隆抗体浓度从0.5 mg/mL到200 mg/mL范围内的动态粘度。b) 温度依赖性粘度：以1°C/min的降温速率，测量20 mM组氨酸缓冲液及含0.5、5、150 mg/mL单克隆抗体的溶液在冷却过程中的粘度变化，直至冰晶形成阻止测量。
四、 主要研究结果 1. 三维温度分布与SDD性能验证： 温度测绘结果清晰地区分了不同容器的冷冻行为。 独立的125毫升瓶冷冻最快，过程时间仅约2.5小时，冷冻前沿从外壁向几何中心推进，中心是最后冻结点。 2升瓶的过程时间显著延长至约7.5小时，冷冻同样从暴露的边缘开始，但最后冻结点也是几何中心。 关键的发现是，装载在SDD中的125毫升瓶（同样装有100 mL溶液）的冷冻行为发生了根本性改变。 SDD不仅将过程时间延长至与2升瓶相当的7.5小时，更重要的是，它逆转了冷冻方向。 在SDD中，冷冻从暴露的边缘开始，经过几何中心，最后到达被绝缘的边缘。 这意味着，SDD中的最后冻结点不再是瓶子的几何中心，而是被绝缘的边缘区域。 这一结果与CFD模拟的设计目标一致，即通过局部绝缘改变了热传递路径，使小规模容器的热历史（应力时间分布）能够匹配大规模容器特定区域的行为。 数据表明，SDD在模拟2升瓶的总体过程时间和内部温度梯度方面表现优异，尽管在某些位置的绝对冷冻时间存在微小差异。
2. 冷冻浓缩分布的比较： 冷冻浓缩分析提供了更深入的证据，证明SDD能够有效模拟大规模冷冻的复杂性。 * 125毫升瓶：冷冻浓缩程度相对较弱（单克隆抗体CF：0.72-1.13；组氨酸CF：0.53-1.41），浓度分布呈十字形，从顶部到底部、从边缘到中心逐渐增加。 值得注意的是，单克隆抗体与组氨酸的CF比值在不同位置变化显著，表明两种分子的扩散行为不同。 * 2升瓶：显示出更显著的冷冻浓缩效应（单克隆抗体CF：0.54-1.37；组氨酸CF：0.48-2.27）和更复杂的空间分布模式。 浓度呈现同心圆状变化：外层区域被稀释，内层区域被浓缩。 最引人注目的发现是一个意外的稀释核心出现在几何中心（最后冻结点）。 此外，在顶部冰壳下形成了高浓度的区域。 单克隆抗体与组氨酸的比值在壁面偏向单克隆抗体，而在底部和中心则偏向组氨酸。 * SDD：成功预测了2升瓶中观察到的关键现象。 SDD的结果（单克隆抗体CF：0.54-1.32；组氨酸CF：0.41-1.51）在对称扩展后，显示出了与2升瓶相似的同心圆状浓度变化以及同样存在于最后冻结点（此处为绝缘边缘）的稀释核心。 单克隆抗体与组氨酸的分布差异也被重现。 这强有力地证明，SDD不仅模拟了整体的冷冻浓缩程度，还捕捉到了大规模冷冻中特有的、非直观的空间异质性和溶质分选效应。 研究推测，2升瓶中的稀释核心可能是由于冻结过程中体积膨胀导致剩余液体被挤出顶部形成的冰壳所致。
3. 初始蛋白质浓度（粘度）对冷冻浓缩的影响： 粘度测量结果显示，单克隆抗体溶液的粘度随浓度呈指数增长（0.5-200 mg/mL范围内从1.8 mPa·s增至19.1 mPa·s），且150 mg/mL高浓度溶液的粘度在降温过程中急剧上升（从20°C的7.7 mPa·s升至-7°C的约30 mPa·s），而低浓度溶液的粘度变化与缓冲液相似。 冷冻浓缩实验结果与此直接相关： * 低浓度 (0.5 和 5 mg/mL)：两者由于粘度较低且温度依赖性相似，表现出可比且显著的冷冻浓缩，空间分布模式也类似。 组氨酸由于分子量小、扩散系数高，比单克隆抗体更容易从冰锋前沿扩散开，导致在最后冻结区域组氨酸的浓缩更为明显。 * 高浓度 (150 mg/mL)：冷冻浓缩效应被几乎完全抑制（单克隆抗体和组氨酸的CF均在0.90-1.06窄范围内）。 整个实体内的浓度分布非常均匀，单克隆抗体与组氨酸的比值在所有位置都接近1。 机理解释：根据斯托克斯-爱因斯坦方程和格拉晓夫数，溶液的动态粘度直接影响溶质扩散和冷冻界面附近的自然对流。 在高粘度下，自然对流被强烈抑制，限制了冷冻浓缩的宏观发展；同时，高粘度也极大地降低了所有溶质（无论大小）的扩散速度，使得单克隆抗体和组氨酸被“锁定”在原地，无法发生显著的分选或积累，从而几乎观察不到浓度梯度和组分差异。
五、 研究结论与价值 结论： 本研究证实，所开发的新型缩小规模装置 (SDD) 能够准确模拟单克隆抗体溶液在2升PET瓶中的大规模冷冻行为。 该装置通过匹配“应力时间分布”而非简单地模仿几何形状或总冷冻时间，成功地重现了大规模冷冻的关键特征，包括三维温度分布、宏观冷冻浓缩的程度与空间模式（如同心圆状变化和稀释核心），以及不同大小溶质（单克隆抗体 vs. 缓冲液组分）的差异化分布行为。 此外，研究明确了初始蛋白质浓度（通过影响溶液粘度）是控制冷冻浓缩程度的关键因素：低粘度溶液导致显著的、受扩散和对流影响的冷冻浓缩；而高粘度溶液则能几乎完全抑制宏观冷冻浓缩和溶质分选。
科学价值与应用价值： * 科学价值：该研究深化了对生物药大规模冷冻过程中质量传递和热传递耦合现象的理解，特别是揭示了溶液粘度在调控冷冻浓缩和溶质空间分布中的核心作用。 提出的基于CFD和“应力时间”匹配的缩小规模策略，为生物工艺的缩小模型设计提供了新的理论框架和方法学。 * 应用价值：该SDD作为一种物料节约和成本高效的工具，能够在药物开发早期，仅使用少量（100 mL）珍贵原料药，即可预测和优化大规模（1.6 L）冷冻工艺。 它可以用于评估不同处方组成、冷冻协议和容器对产品可能产生的冷冻相关应力的影响，从而在进入大生产前识别潜在风险（如过度浓缩、pH或离子强度局部变化），保障产品质量和稳定性。
六、 研究亮点 1. 创新的缩小规模策略：摒弃传统的几何或时间缩放，采用基于CFD模拟的“应力时间分布”匹配方法，设计出能精确复制大规模冷冻热力学和质量传递行为的SDD。 2. 捕捉非直观现象：SDD不仅预测了整体浓缩程度，更成功重现了大规模冷冻中出现的复杂空间异质性，如同心圆浓度梯度和关键的稀释核心现象，这些现象在传统的小规模实验中无法观察到。 3. 揭示粘度关键作用：通过系统的实验，明确证明了溶液粘度是决定宏观冷冻浓缩程度和溶质分选行为的主导因素，为处方开发提供了明确的指导：高浓度/高粘度处方可有效抑制冷冻浓缩。 4. 多参数综合评价：研究结合了三维温度测绘和三维溶质浓度分布分析（同时针对蛋白质和缓冲盐），对SDD的性能进行了全面、立体的验证，结论坚实可靠。 5. 解决实际工业痛点：直接针对生物制药行业大规模瓶装冷冻缺乏可靠缩小模型的难题，提供了一个经过严谨验证的实用化解决方案。
七、 其他有价值内容 研究在讨论部分对观察到的现象进行了深入的物理解释。例如，对于稀释核心的形成，提出了在冷冻末期由于冰的体积膨胀导致内部液体受压并可能穿透顶部冰壳的假设。对于单克隆抗体与组氨酸的分布差异，则归因于两者扩散系数的不同。这些机理探讨增强了研究的深度。 作者也指出，解冻过程同样是影响产品质量的关键步骤，并提及对SDD在解冻过程中性能的研究正在进行中，体现了工作的延续性和完整性。