该文档报告了一项关于在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中表达、激活及表征猪胰蛋白酶（porcine trypsin）的原始研究。研究由湖北大学生命科学学院、工业生物技术湖北省重点实验室及生物资源绿色转化湖北省协同创新中心的Min Shu、Wei Shen、Xiaojuan Wang、Fei Wang、Lixin Ma和Chao Zhai等人完成。通讯作者为Lixin Ma（邮箱：malixing@hubu.edu.cn）和Chao Zhai（邮箱：chaozhai@hotmail.com）。该研究于2015年4月10日投稿，2015年5月26日修订，2015年6月22日被《Protein Expression and Purification》接收，文章编号为YPREP 4723，DOI为http://dx.doi.org/10.1016/j.pep.2015.06.014。

一、研究的学术背景

胰蛋白酶（trypsin，EC 3.4.21.4）是丝氨酸蛋白酶家族的典型成员，能够特异性地在碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸的羧基端切割肽键。该酶广泛存在于细菌、真菌和哺乳动物中，在哺乳动物体内与代谢、消化和凝血等生理过程密切相关。在体内，胰蛋白酶以无活性的酶原形式（trypsinogen）由胰腺分泌，须经肠激酶（enterokinase）激活后才具有催化活性，否则活性胰蛋白酶会导致机体自身损伤。猪胰蛋白酶原的前肽含有6个氨基酸（VDDDDK），该序列在哺乳动物中高度保守。传统上胰蛋白酶主要从动物器官和组织中提取，但近年来需求不断增加，传统方法产量有限且存在工艺复杂、潜在病原污染等问题，因此异源表达成为研究热点。此前已有利用大肠杆菌表达大鼠和人胰蛋白酶的报道，但大肠杆菌系统表达的活性酶产量极低，且多数蛋白以包涵体形式存在；利用毕赤酵母表达牛胰蛋白酶原和灰色链霉菌胰蛋白酶原虽获成功，但产量较低且需肠激酶激活。由于毕赤酵母表达系统是目前最成功的异源蛋白表达系统之一，且猪胰蛋白酶活性高于其他哺乳动物来源的胰蛋白酶，本研究旨在利用毕赤酵母GS115表达猪胰蛋白酶原并实现激活。

二、研究的详细流程

研究首先根据NCBI数据库中猪胰蛋白酶蛋白序列（GenBank登录号P00761），在其C端添加6个组氨酸标签（His-tag），并按照毕赤酵母密码子偏好性设计优化了全长702 bp的DNA序列，排除部分限制性酶切位点。基因合成采用重叠PCR策略，通过24条寡核苷酸引物（ptry-1至ptry-24）分步合成，其中ptry-1和ptry-24的末端分别带有CpoI和NotI限制性位点。PCR产物经MutS蛋白处理以减少碱基错配、短缺失和插入，该处理重复两次以提高合成准确性。合成片段经T4 DNA聚合酶处理后与经NotI和CpoI酶切的表达载体pHBM905A连接，转化大肠杆菌XL10-Gold，经菌落PCR和DNA测序验证获得重组质粒pHBM905A-ptry。重组质粒经SalI线性化后电转化毕赤酵母GS115，在不含组氨酸且含0.4 mg/L生物素的MD平板上筛选转化子，并以菌落PCR鉴定阳性克隆，空载体pHBM905A作为阴性对照。

在摇瓶表达阶段，重组毕赤酵母菌株在500 mL摇瓶中以100 mL BMGY培养基28°C、200 rpm培养48 h，离心收集细胞后重悬于50 mL BMMY培养基中，每24 h添加1%（v/v）甲醇诱导表达，总诱导时间144 h，每24 h取样1 mL，7000×g离心5 min去除细胞。表达产物通过SDS-PAGE（5%浓缩胶、12%分离胶）和Western blotting鉴定，使用His-tag抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗。总蛋白浓度采用Bradford法测定。

重组蛋白的纯化流程为：收集诱导96 h的发酵上清，7000×g离心10 min，经0.22 µm滤膜过滤后，用Millipore 10 kDa截留膜透析去除离子和盐，重悬于缓冲液A（20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、20 mM咪唑，pH 7.4），上样至预先用至少5倍柱体积缓冲液A平衡的HiTrap IMAC FF 1 mL亲和层析柱，流速1 mL/min，待吸光度达到稳定基线后，用缓冲液B（20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、500 mM咪唑，pH 7.4）洗脱，收集峰组分，再经10 kDa截留膜透析至100 mM Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液中，SDS-PAGE分析纯化效果。

激活实验方面，将肠激酶与纯化的胰蛋白酶原混合，16°C孵育20 h；同时在不同pH条件下（pH 5.5–10.0的柠檬酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液和硼酸缓冲液）处理重组胰蛋白酶原，每12 h测定酶活性，总孵育时间84 h，以研究pH对自催化激活的影响，并利用SDS-PAGE分析激活前后蛋白条带变化。

酶活性测定包括定性和定量方法。定性分析采用酪蛋白琼脂平板法，将发酵上清置于含1%酪蛋白和2%琼脂的平板上，根据水解圈大小和透明度判断表达水平和活性。定量分析以Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯胺（BAPNA）为底物，在100 mM Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液中监测410 nm处吸光度变化，每30 s记录一次数据。一个BAPNA单位（U/mL）定义为在上述条件下使吸光度增加0.1所需的酶量。酶学性质表征包括：在最适pH和温度测定中，分别在不同温度（10–60°C）和pH（5.5–10.0）条件下测定酶活性；热稳定性实验将酶液分别在30°C、35°C和40°C孵育30 min，每10 min测定残余活性。

在5 L发酵罐中，将新鲜菌落接种至200 mL YPD培养基中28°C、200 rpm培养36 h，然后转移至含2 L发酵基础盐培养基的5 L发酵罐中。发酵过程中温度维持30°C，诱导前pH调至5.0，甲醇补料开始后调至4.5，溶解氧浓度维持在20%以上。当甘油耗尽后，补加含1.2% PTM1微量盐的50%甘油；当湿重达到180–220 g/L时，终止甘油补料，开始以含12 mL PTM1微量盐/L甲醇的100%甲醇进行诱导，总诱导时间108 h，每12 h取样分析。

三、主要结果

摇瓶表达结果显示，SDS-PAGE在24.3 kDa处出现明显蛋白条带，Western blotting证实该条带为带有His标签的重组胰蛋白酶原。表达量在72 h达到最高，蛋白浓度约220 mg/L，144 h时降至201 mg/L，表明在毕赤酵母中成功实现了胰蛋白酶原的表达。

发酵罐高密度发酵结果显示，SDS-PAGE分析表明诱导60 h后重组胰蛋白酶原条带发生缩短，出现两条带，且缩短后的条带在96 h时成为主带。BAPNA定量分析和酪蛋白琼脂平板定性分析均表明酶活性随诱导时间增加而升高，96 h达到最大值。Bradford法测定总蛋白显示，重组蛋白产量在48 h前随时间增加，之后有所下降；湿重分析表明细胞产量在96 h前持续增加，之后开始减少。最终重组蛋白产量为0.48 mg/mL，最大酶活性为19.2 U/mL。

纯化结果经SDS-PAGE分析显示，亲和层析后得到单一条带，表明大部分毕赤酵母内源蛋白被有效去除。纯化过程中比活力从粗酶液的16.27 U/mg提高到亲和层析后的34.29 U/mg，纯化倍数为2.11，回收率为65.83%。

激活实验结果表明，重组胰蛋白酶原在不同pH缓冲液中孵育36 h前活性无明显差异，几乎所有样品在72 h达到最大活性，其中pH 8.0为最适激活条件，最大活性为18.7 U/mL。SDS-PAGE分析显示，在pH 8.0条件下处理72 h可使胰蛋白酶原完全激活，且该处理与肠激酶处理24 h的效果相似。研究还发现，在分批补料发酵后期，前肽从重组蛋白上被切割，酶原自发转变为活性胰蛋白酶，激活过程可通过改变pH启动，这是首次报道猪胰蛋白酶原在毕赤酵母中的自激活现象。

酶学性质表征显示，重组胰蛋白酶的最适反应温度为35°C，最适pH为8.5。热稳定性实验表明，在最适温度35°C下孵育30 min后，重组酶仍保留80%的残余活性，显示出较好的热稳定性。

四、结论与意义

本研究成功利用毕赤酵母GS115表达系统克隆并表达了猪胰蛋白酶原，提供了一种基本适合规模化生产重组胰蛋白酶的方法。在5 L发酵罐中获得0.48 mg/mL的蛋白产量和19.2 U/mL的酶活性，高于此前报道的灰色链霉菌胰蛋白酶在毕赤酵母中的14.4 U/mL。该研究还首次报道了猪胰蛋白酶原在毕赤酵母中的自激活现象，并提出通过调节pH实现酶原激活的方案，该策略可能同样适用于其他酶原的表达和激活。研究认为，自激活可能是由毕赤酵母内源蛋白酶在发酵后期分泌到上清中，切割重组猪胰蛋白酶原前肽而启动的级联放大过程。此外，虽然重组蛋白以胰蛋白酶原形式分泌，避免了活性酶对宿主细胞的毒性，但在发酵后期仍发生自激活，这为在毕赤酵母中表达其他蛋白酶类酶原提供了重要参考。本研究成果为胰蛋白酶的异源生产提供了新的技术路线，对皮革加工、生物技术加工、医药和食品加工等领域的应用具有潜在价值。

五、研究亮点

本研究的亮点在于：首次在毕赤酵母中成功表达猪胰蛋白酶原，并实现了高密度发酵下的较高产量和酶活性；首次报道了猪胰蛋白酶原在毕赤酵母发酵后期的自激活现象，揭示了pH在激活过程中的关键作用；提供了一种无需额外添加肠激酶、仅通过调节pH即可实现酶原高效激活的简便策略。此外，研究采用了密码子优化、重叠PCR与MutS纠错相结合的全基因合成方法，以及亲和层析与超滤相结合的纯化流程，为其他同源蛋白的异源表达和纯化提供了可借鉴的范式。