《Molecular Neurobiology》(2025)发表的一项关于褪黑素延缓听觉细胞衰老的原创研究

第一作者及研究机构
本研究的通讯作者为Yan Qu（河北医科大学第三医院耳鼻咽喉科），第一作者为Yongqing Ding（河北医科大学第三医院与河北北方大学附属第一医院联合培养）。其他合作者来自河北北方大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科。研究于2025年4月发表于《Molecular Neurobiology》期刊（Volume 62, Pages 9902–9915）。

学术背景与研究目标
年龄相关性听力损失（age-related hearing loss, ARHL）是一种与耳蜗感觉细胞退化相关的常见老年性疾病，其分子机制尚未完全阐明。近年研究发现，NLRP3炎症小体（NLRP3 inflammasome）激活与多种衰老相关疾病（如心血管疾病、神经退行性疾病）密切相关，但其在耳蜗毛细胞衰老中的作用尚不明确。此外，细胞焦亡（pyroptosis）——一种由NLRP3/caspase-1/GSDMD-N通路介导的炎症性程序性细胞死亡——是否参与ARHL亦缺乏证据。褪黑素（melatonin）因其抗氧化和抗炎特性，已被证明可抑制NLRP3炎症小体，但能否通过调控焦亡延缓耳蜗毛细胞衰老仍需探索。

本研究旨在：(1) 建立过氧化氢（H₂O₂）诱导的小鼠听觉细胞系HEI-OC1衰老模型；(2) 验证NLRP3炎症小体介导的焦亡是否参与细胞衰老；(3) 评估褪黑素通过抑制焦亡通路对衰老的干预效果。

实验设计与方法
研究分为以下关键步骤：

1. 细胞衰老模型构建

   • 研究对象：小鼠听觉细胞系HEI-OC1（由河北医科大学Yan Zhang博士馈赠），培养条件为33°C、10% CO₂。
     
   • 诱导衰老：用不同浓度H₂O₂（6.25–800 μM）处理细胞1小时，移除H₂O₂后继续培养24–72小时。通过CCK-8法检测细胞活力，SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色评估衰老表型，显微镜观察形态变化。结果显示，50 μM H₂O₂处理48小时后细胞活力降至48%，SA-β-gal阳性率显著升高，细胞呈现核增大、分支增多等衰老特征。
     

2. NLRP3炎症小体与焦亡通路验证

   • 蛋白检测：通过免疫荧光和Western blot分析H₂O₂处理后NLRP3、caspase-1及GSDMD-N的表达。结果显示，50–100 μM H₂O₂组中，NLRP3和caspase-1蛋白水平显著升高（p < 0.001），GSDMD-N表达亦呈浓度依赖性增加，证实焦亡通路激活。
     

3. 褪黑素干预实验

   • 剂量筛选：预实验发现100 μM褪黑素预处理3小时可最有效提升H₂O₂损伤后的细胞活力（48小时存活率从48%升至76.39%）。更高浓度（>200 μM）保护效果反而减弱，可能与褪黑素的“双相作用”（低剂量抗氧化、高剂量促氧化）有关。
     
   • 机制验证：Western blot显示，褪黑素（100 μM）显著抑制NLRP3、caspase-1及GSDMD-N的表达（p < 0.0001），且SA-β-gal阳性率下降，表明其通过阻断焦亡延缓衰老。
     

主要结果与逻辑关联
- H₂O₂诱导的衰老模型：50 μM H₂O₂处理48小时可稳定诱导HEI-OC1细胞衰老，伴随焦亡通路关键蛋白（NLRP3/caspase-1/GSDMD-N）上调。此结果支持“氧化应激通过NLRP3炎症小体触发焦亡，进而促进衰老”的假设。
- 褪黑素的保护作用：褪黑素通过抑制NLRP3炎症小体组装及下游GSDMD-N切割，减少细胞焦亡，从而改善细胞活力与形态。这一发现将褪黑素的抗衰老机制与焦亡调控直接关联。

结论与价值
本研究首次揭示：(1) NLRP3炎症小体介导的焦亡是耳蜗毛细胞衰老的新机制；(2) 褪黑素通过靶向NLRP3/caspase-1/GSDMD-N轴延缓衰老。其科学价值在于为ARHL提供了新的分子靶点（如GSDMD-N），应用价值在于提示褪黑素或可作为ARHL的潜在治疗剂，尤其适用于老年人群的预防性干预。

研究亮点
1. 创新性机制：首次将焦亡与耳蜗毛细胞衰老关联，拓展了对ARHL病理机制的理解。
2. 方法学严谨性：结合SA-β-gal染色、免疫荧光共聚焦显微镜（Nikon A1 HD 25）及多时间点动态检测（24–72小时），确保数据可靠性。
3. 转化医学意义：褪黑素作为已获批临床使用的激素，其安全性为后续动物实验及临床试验奠定基础。

局限性
1. 未直接检测ASC寡聚化或IL-1β释放，需进一步验证炎症小体组装。
2. 未定量焦亡细胞比例，需结合流式细胞术或LDH释放实验完善。
3. 仅使用体外模型，需在动物（如老年小鼠）中验证褪黑素效果。

未来方向
作者计划在动物模型中验证褪黑素对ARHL的干预效果，并探索其是否通过调节衰老相关分泌表型（SASP）影响周围细胞微环境。