本研究的主要作者为Kaixiang Zhang，工作单位为清华大学药学院、膜生物学国家重点实验室、清华-北大生命科学联合中心、生物有机磷化学与化学生物学教育部重点实验室。合作作者来自北京大学第一医院胸外科、北京大学第一医院GI外科以及清华大学生命科学学院。通讯作者为清华大学的Ying Zhang教授和Hang Yin教授。该研究发表于期刊《Advanced Science》，论文于2026年1月修订并接受，发表时间应为2026年。
这项研究属于细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）生物学和RNA转运机制的交叉领域，具体聚焦于细胞外囊泡如何选择性包装信使RNA（mRNA）这一核心科学问题。细胞外囊泡是细胞分泌的膜性小泡，携带蛋白质、脂质和核酸等物质，是介导细胞间通讯的重要媒介，在免疫、发育和包括癌症在内的多种疾病进程中发挥关键作用。尽管已有研究发现EVs能够携带并传递功能性的mRNA至受体细胞，并影响其基因表达，但对于特定的mRNA是如何被精准筛选并装载进EVs的分子机制，学界仍知之甚少。以往的研究较多关注微小RNA（miRNA）的装载机制，而mRNA的筛选过程则是一个亟待填补的知识空白。基于此，本研究旨在揭示负责将mRNA分选进EVs的关键蛋白及其作用机制，并探索该机制在非小细胞肺癌（NSCLC）等疾病中的潜在病理意义。
详细的研究流程可分为以下几个主要环节，每个环节环环相扣，共同支撑了最终结论。
首先，通过相互作用组捕获技术筛选EVs中潜在的mRNA结合蛋白。 研究者从HeLa细胞的培养上清液中通过差速离心法分离出EVs，并利用透射电镜和纳米颗粒追踪分析进行表征，确认其符合国际标准。随后，采用“相互作用组捕获”策略来鉴定EVs中与多聚腺苷酸（poly(A)）RNA结合的蛋白质。该方法对HeLa细胞来源的EVs进行紫外交联，使RNA与结合蛋白共价连接，接着使用寡聚dT磁珠捕获poly(A) RNA及其结合蛋白，经RNase消化去除RNA后，通过液相色谱-串联质谱分析捕获的蛋白质组。蛋白组学分析在EVs中鉴定出213个poly(A) RNA结合蛋白。通过细胞组分和功能聚类分析，筛选出富集在“细胞外外泌体”和“poly(A) RNA结合蛋白”类别中的候选蛋白。通过对几个候选RNA结合蛋白进行基因敲低实验，发现仅核仁磷酸蛋白1（Nucleophosmin 1, NPM1）的敲低会显著降低EVs中一种丰度较高的模型mRNA——延伸因子1α1（EEF1A1）的水平，而细胞内的水平未受影响。这提示NPM1可能参与mRNA向EVs的特异性分选。随后的poly(A) RNA Pull-down实验也证实了NPM1确实具有结合mRNA的能力。
其次，利用基因敲除和测序技术确认NPM1选择性分选特定mRNA进入EVs，并验证其功能。 为了深入研究NPM1的功能，研究者利用CRISPR-Cas9技术构建了NPM1敲除（KO）的HeLa细胞系。Western blot确认从KO细胞分离的EVs中不含NPM1蛋白，但EVs标志蛋白水平正常。对野生型（WT）和NPM1-KO细胞来源的EVs进行RNA-seq分析，结果显示，NPM1敲除后，EVs中数千种mRNA的水平显著下降，而在亲本细胞中这些mRNA的水平基本不变，这表明NPM1的作用是促进mRNA从细胞向EVs的运输，而非影响其细胞内的总丰度。生物信息学分析发现，这些受NPM1影响而下调的EV mRNA与多种癌症相关，特别是非小细胞肺癌。研究者选取了几个癌症相关mRNA（如EGFR, IGF2R, TKL2）和两个变化不明显的对照mRNA（RPL5, TAF15）进行qPCR验证，结果与测序数据一致：癌症相关mRNA在NPM1-KO EVs中显著减少，而对照mRNA无变化。RNA免疫共沉淀实验进一步证实，NPM1能够直接结合EGFR、IGF2R等mRNA，而不结合对照mRNA。功能实验表明，将HeLa WT细胞来源的EVs与HEK293T受体细胞共培养，可以显著提升受体细胞中这些癌症相关mRNA及其蛋白（如EGFR）的水平；而使用NPM1-KO细胞来源的EVs处理，则无法产生此效果。这证明了NPM1介导的EV-mRNA递送具有功能上的生物学效应。
第三，在临床样本中验证NPM1与癌症相关mRNA（以EGFR为例）在EVs中的相关性。 为了探究该机制的病理生理学意义，研究者收集了18名非小细胞肺癌患者和18名健康供者的血清，分离其中的EVs。纳米颗粒追踪分析显示两组EVs的粒径和浓度无差异。然而，Western blot和qPCR分析发现，与健康供者相比，肺癌患者血清EVs中的NPM1蛋白水平和EGFR mRNA水平均显著升高。进一步的相关性分析显示，EVs中NPM1蛋白的丰度与EGFR mRNA的水平呈显著正相关。这一临床数据将细胞模型中的发现延伸至疾病情境，提示NPM1介导的mRNA分选机制可能与NSCLC的发病机制相关。
第四，鉴定NPM1结合的RNA基序（motif）并验证其功能。 为了阐明NPM1如何特异性识别mRNA，研究者利用生物信息学工具STREME，通过比较WT细胞与EVs之间、以及WT EVs与NPM1-KO EVs之间的mRNA序列，寻找富集的RNA基序。分析发现了一个8核苷酸的核心基序“CUGGGAUU”。值得注意的是，该基序存在于EGFR、IGF2R等受NPM1调控的mRNA中，而不存在于不受调控的RPL5、TAF15 mRNA中。RNA Pull-down实验证实，含有该基序的RNA探针能够特异性地拉下NPM1蛋白。AlphaFold3的结构预测也支持NPM1的C端与该基序（尤其是“GGAUU”部分）存在相互作用。为验证该基序的功能，研究者建立了一个基于Cre-LoxP重组系统的报告系统。他们将“CUGGGAUU”基序连接到Cre mRNA的3‘端，转染至供体细胞。这些细胞产生含有“基序-Cre” mRNA的EVs，将其与含有LoxP-DsRed-Stop-EGFP报告基因的受体细胞共培养。如果EVs成功递送Cre mRNA并在受体细胞中翻译出Cre蛋白，就会发生重组，使受体细胞从表达DsRed转为表达EGFP。流式细胞术分析显示，与连接普通Cre mRNA的EVs相比，连接了“CUGGGAUU”基序的Cre mRNA能更有效地被包装进EVs，并导致更高比例的受体细胞转为EGFP阳性。然而，当使用NPM1-KO细胞作为供体时，这种由基序带来的增强效应完全消失。qPCR也直接证实，在WT供体细胞中，基序能显著增加Cre mRNA在EVs中的含量；但在NPM1-KO细胞中则不能。这些实验强有力地证明了“CUGGGAUU”是NPM1依赖性的EV-mRNA分选基序。
第五，探究NPM1-mRNA复合物的细胞内定位及运输途径。 明确识别机制后，研究者进一步探索NPM1-mRNA复合物是如何被引导进入EVs生成途径的。通过蔗糖密度梯度离心和免疫荧光共定位实验，他们发现细胞质中的NPM1与晚期内体（late endosome）和多泡体（multivesicular body, MVB）的标志物（如CD63、VPS16）共定位，而不与早期内体或内质网等标志物共定位。当将带有“CUGGGAUU”基序的Cy5标记的EGFR mRNA片段导入细胞后，超分辨成像显示，NPM1、CD63（MVB标志物）和RNA探针可以在同一个EV颗粒中共定位。活细胞成像进一步揭示了动态过程：NPM1与RNA先在细胞质中形成颗粒，随后这些颗粒被CD63阳性的MVB所包裹。定量分析确认，NPM1与RNA的共定位主要发生在晚期内体和MVB中。这表明，NPM1-mRNA复合物是通过被晚期内体/MVB系统识别并内化，最终被分泌为EVs的。
第六，揭示NPM1通过液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）凝聚mRNA的分子机制。 最后，研究者深入探究了NPM1介导mRNA聚集和包装的物理化学机制。鉴于NPM1是一种已知易发生相分离的蛋白，他们假设NPM1通过相分离与mRNA形成生物分子凝聚物（condensate），从而促进其被MVB包装。预测分析显示NPM1含有内在无序区域（IDR）。在体外，将纯化的NPM1蛋白与Cy3标记的RNA探针混合，可以观察到动态的液滴状凝聚物的形成。荧光漂白恢复实验证实，凝聚物中的NPM1和RNA分子都具有流动性，符合液-液相分离的特征。实验表明，NPM1浓度是相分离的主要驱动力，而RNA的存在则能增加凝聚体的数量。当使用缺失N端的NPM1截短体（保留RNA结合能力但失去自相互作用能力）时，单独蛋白无法形成凝聚物，但加入RNA后却能诱导其形成，突出了RNA结合在相分离中的关键作用。更有趣的是，当将NPM1-RNA凝聚物与用荧光染料标记的EVs膜共同孵育时，膜成分能够整合进入凝聚物中。活细胞成像最终捕捉到了完整的动态链条：NPM1首先与RNA在细胞质中形成相分离凝聚物，随后这些凝聚物招募MVB标志蛋白CD63，最终被MVB包裹。
本研究的主要结论是：核仁磷酸蛋白1（NPM1）是介导特定mRNA分选进入细胞外囊泡的关键蛋白。它通过识别mRNA中特异的“CUGGGAUU”八核苷酸基序，并利用其固有的液-液相分离能力，与这些mRNA形成动态的生物分子凝聚物。这些凝聚物随后被晚期内体/多泡体系统识别和包裹，最终被分泌到细胞外成为EVs的货物。 该机制在病理状态下具有重要意义，如在非小细胞肺癌患者血清EVs中，NPM1蛋白和其介导运输的EGFR mRNA水平均显著升高且相互关联。
该研究的科学价值在于，首次系统性地揭示了一个由RNA结合蛋白、特异性RNA基序和液-液相分离三者协同作用，共同调控mRNA选择性装载入EVs的完整分子机制。这极大地推进了我们对EV货物分选，特别是长链mRNA分选机制的理解，填补了该领域的一个重要知识空白。其应用价值体现在两个方面：一方面，为理解EVs在癌症等疾病中介导的细胞间通讯，尤其是致癌性mRNA（如EGFR mRNA）的扩散，提供了新的分子视角和潜在的治疗靶点（如NPM1或其所识别的RNA基序）。另一方面，研究所鉴定的EV分选基序“CUGGGAUU”，为未来人工设计能够高效装载特定mRNA进入EVs的载体系统，从而开发基于EVs的RNA递送疗法，提供了重要的理论依据和技术思路。例如，研究者在文末展示，通过在EGFR mRNA的3‘UTR中加入该基序，可以显著增强其在EVs中的装载量及对受体细胞的影响，验证了利用该基序调控细胞间mRNA运输的可行性。
本研究的亮点突出表现在以下几个方面：1. 重要的原创性发现： 首次鉴定出NPM1作为EV-mRNA分选的关键调控因子，并阐明其通过结合特异性RNA基序和相分离来发挥功能的双重机制。2. 严谨且多层次的研究策略： 研究从蛋白质组学筛选出发，结合基因编辑、高通量测序、基序分析、功能验证（Cre-LoxP系统）、细胞定位、体外生化重建（相分离）和临床样本验证，构建了一个逻辑严密、证据链完整的闭环研究体系。3. 机制的深度与新颖性： 将液-液相分离这一前沿的细胞生物学概念与EV的生物发生过程直接联系起来，为理解无膜细胞器与膜性细胞器之间的交互提供了新的范例。4. 临床相关性： 成功将基础研究发现与人类疾病（NSCLC）相关联，提升了研究的转化医学潜力。5. 技术方法的创新应用： 巧妙地改造并运用Cre-LoxP报告系统来定量评估RNA基序对EV装载效率的影响，是一项非常具有说服力的功能验证实验。这项研究不仅在基础理论上有重要突破，也为未来的疾病诊断和治疗策略开发开辟了新的方向。