本研究由Juryun Kim（第一作者）、Yoojun Nam（并列第一作者）及包括Yeri Alice Rim（通讯作者）和Ji Hyeon Ju（通讯作者）在内的多位研究人员组成的团队完成。研究团队主要来自韩国的多家机构：yipscell inc.、成均馆大学、首尔圣玛丽医院天主教大学医学院的Cistem实验室。该研究成果已于2025年3月14日在线发表于学术期刊 *Experimental & Molecular Medicine*（第57卷，第686-699页）。
本研究属于再生医学与免疫学交叉领域，具体聚焦于细胞治疗中的免疫排斥问题。诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells， iPS细胞）因其无限增殖和分化为各种体细胞的潜能，被视为细胞疗法和再生医学的理想细胞来源。然而，同种异体移植时，供体细胞表面的人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen， HLA）会被受体的免疫系统识别为“非己”，进而引发由T细胞（包括CD4⁺辅助性T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞）和自然杀伤（Natural Killer， NK）细胞介导的免疫排斥反应，这严重阻碍了iPS细胞的广泛应用。
传统解决方案包括使用患者自体iPS细胞（自源移植）或寻找HLA配型相合的异体供体。但自源移植成本高昂、耗时漫长，而异体HLA完全匹配的供体极为稀缺。虽然建立涵盖常见纯合HLA类型的iPS细胞库可以覆盖部分人群（例如日本的研究显示140个纯合iPS细胞可覆盖90%人口），但仍无法实现全民覆盖，且筛选和维持大量细胞系资源密集。因此，科学家们致力于通过基因编辑技术，对iPS细胞的HLA基因进行改造，旨在创造出可逃避宿主免疫系统识别、适用于广大患者的“通用型”或“低免疫原性”iPS细胞。
HLA复合体位于人类第6号染色体，分为I类和II类。HLA I类分子（如HLA-A、-B、-C）由一条高度多态性的α链和一条非多态性的β2微球蛋白链组成，主要向CD8⁺ T细胞呈递抗原。HLA II类分子（如HLA-DR、-DQ、-DP）由α链和β链组成，两者均具多态性，主要向CD4⁺ T细胞呈递抗原。其中，HLA-A和HLA-B是多态性最高的位点，也是引发强烈移植排斥反应的主要因素。
先前的研究已尝试利用CRISPR-Cas9等基因编辑工具敲除HLA I类基因（如敲除β2微球蛋白以破坏所有I类分子表达）和/或HLA II类基因（如敲除II类反式激活因子CIITA）。但完全消除HLA I类分子可能导致NK细胞的攻击增强，因此需要更精细的编辑策略，例如选择性保留某些分子（如HLA-C、HLA-E/G）以抑制NK细胞活性。
本研究的目标是：利用CRISPR-Cas9系统，在具有杂合HLA基因型的外周血单核细胞（PBMC）来源的iPS细胞系（YIP3）中，同时敲除与T细胞应答密切相关的HLA-A、HLA-B和HLA-DRA基因，从而构建低免疫原性的通用型iPS细胞。与多数使用纯合子iPS细胞进行编辑的研究不同，本研究直接针对更常见的杂合子细胞进行操作，更具普遍意义。特别值得一提的是，针对HLA-DR区，研究团队选择了敲除编码恒定α链的*HLA-DRA*基因，而非通常靶向的编码可变β链的*HLA-DRB1*基因，这一策略旨在更彻底地破坏整个HLA-DR分子的结构，避免因其他*DRB*基因（如*DRB3*、*DRB4*、*DRB5*）的表达而产生残留的II类分子活性。
本研究流程严谨，涵盖了基因编辑设计、克隆筛选、功能验证、遗传稳定性分析和免疫原性评估等多个关键步骤。
1. 实验对象与基因编辑设计 * 研究对象：研究使用的起始细胞系为YIP3，这是一个从PBMC诱导获得、HLA基因型为杂合的iPS细胞系。其具体的HLA等位基因为：HLA-A*11:01:01:01/29:01:01:01；HLA-B*13:02:01:01/58:01:01:01；HLA-C*03:02:02/02:02:02；HLA-DRA*01:02:01/01:01:02。 * 编辑策略：旨在选择性敲除高度多态的HLA-A和HLA-B基因，同时敲除HLA-DRA基因以消除HLA-DR蛋白表达，而保留多态性较低的HLA-C基因（因其对NK细胞有抑制信号）。 * 向导RNA设计：针对每个靶基因（*HLA-A*、*HLA-B*、*HLA-DRA*），研究团队设计了2个候选向导RNA（gRNA）。设计时利用IPD-IMGT/HLA数据库比对两个等位基因的序列，选取两个等位基因共有的、且包含NGG原型间隔相邻基序（PAM）的20bp区域，以确保设计的gRNA能同时对两个等位基因有效。例如，针对*HLA-A*设计了一个靶向外显子2密码子37-43区域的gRNA（g0002-hla-a-g1）。
2. gRNA效率评估与三基因敲除iPS细胞的构建 * gRNA初筛：将每个候选gRNA与Cas9蛋白形成核糖核蛋白复合体，通过电穿孔（使用Lonza 4D-Nucleofector X系统，程序CA-137）转染YIP3细胞池。转染后，通过Sanger测序和ICE分析软件评估每个gRNA的编辑效率。结果显示，*HLA-A*的g0002-hla-a-g1效率最高（91%），*HLA-B*的g0002-hla-b-g1效率最高（78%），*HLA-DRA*的g0002-hla-dra-g1效率最高（99%）。这三个gRNA被选为最终工具。 * 三基因共敲除：将选定的三个gRNA与Cas9蛋白混合形成复合体，以80µg的总gRNA量电穿孔转染100万个YIP3细胞。 * 单细胞克隆筛选：转染后的细胞通过流式细胞术进行单细胞分选，接种到96孔板中培养。研究人员总共收集了48个单克隆。首先对电穿孔后的细胞池进行基因分型（采用下一代测序，NGS），初步筛选出6个潜在的三敲除克隆。随后，通过Sanger测序对候选克隆进行详细的基因型确认。
3. 敲除克隆的表征与筛选 * 基因型确认：Sanger测序证实了两个强候选克隆A7和B2的成功敲除。克隆A7在*HLA-A*、*HLA-B*、*HLA-DRA*位点分别出现了1bp插入、28bp缺失和1bp缺失，且均为纯合突变。克隆B2则分别为1bp插入、34bp缺失和2bp插入。 * 多能性评估： * 形态与标志物：克隆A7和B2保持了典型的iPS细胞克隆形态，并呈碱性磷酸酶染色阳性。 * mRNA水平：定量实时PCR显示，它们与亲本YIP3细胞一样，高表达多能性标志物（OCT4、SOX2、KLF4、LIN28、NANOG），而不表达三胚层分化标志物（SOX17、BRA、PAX6）。 * 蛋白水平：流式细胞术检测显示，超过95%的A7和B2细胞表达多能性表面标志物OCT4、SSEA4、NANOG和TRA-1-60，与YIP3相当。 * 分化潜能：使用三胚层分化试剂盒诱导后，免疫荧光染色证实A7和B2细胞能有效分化为表达SOX17（内胚层）、BRA（中胚层）和PAX6（外胚层）的细胞，证明其完整的体外分化能力。 * 排除次级候选克隆：克隆B3因NANOG蛋白表达水平显著较低（86%）被排除；克隆B11则因核型分析发现6号染色体短臂缺失而被排除。
4. HLA表达分析 * mRNA水平：qRT-PCR分析显示，与YIP3相比，克隆A7和B2中*HLA-A*和*HLA-B*的mRNA表达量显著降低（p<0.01），*HLA-DRA*的表达也降低（p<0.05）。 * 蛋白水平（关键实验）：研究人员进行了一项关键的验证——在干扰素γ（IFN-γ）刺激下检测HLA蛋白表达。IFN-γ是一种强效的免疫调节因子，能显著上调细胞表面的HLA分子表达。 * 未经IFN-γ刺激时，YIP3、A7和B2均不表达或低表达HLA I类和II类蛋白。 * 经IFN-γ刺激2天后，流式细胞术显示，YIP3细胞的HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DR蛋白表达大幅上调（阳性率分别达99.03%、91.61%、88.35%和0.04%）。 * 相比之下，克隆A7在IFN-γ刺激后，HLA-A、HLA-B和HLA-DR蛋白表达几乎完全缺失（阳性率分别为0.07%、0.15%和0.02%），而未被编辑的HLA-C蛋白表达正常（97.34%）。克隆B2结果类似。 * 这一结果在蛋白水平上强有力地证实了基因敲除的成功，并表明即使在强烈的炎症信号（IFN-γ模拟的体内免疫环境）下，编辑后的细胞也不会上调这些关键的免疫识别分子。
5. 遗传稳定性评估 为确保编辑后的细胞安全可用，研究团队对候选克隆进行了全面的遗传学分析。 * 核型分析：克隆A7和B2核型正常，而B11异常。 * 拷贝数变异分析：使用CytoScan HD芯片阵列检测。克隆A7未发现CNV，而克隆B2在2号染色体和6号染色体（包含*HLA-B*和*HLA-DRA*区域）检测到拷贝数丢失，提示其基因组不稳定性，因此A7更优。 * 全基因组测序：对YIP3、A7和B2进行WGS，分析脱靶效应和体细胞突变。 * 脱靶分析：使用Cas-OFFinder软件预测了21个潜在脱靶位点，但在A7和B2的WGS数据中均未发现这些位点存在突变。 * 结构变异：在A7中检测到与靶向敲除相关的*HLA-A*区域28bp缺失；在B2中除了检测到*HLA-A*区域的34bp缺失外，还发现了前述CNV丢失，进一步证实了B2的不稳定性。 * 体细胞突变：未发现可能造成功能影响的体细胞编码变异。 * 转录组分析：RNA测序显示，与YIP3相比，A7和B2中三个靶基因的表达显著下调。A7与YIP3的整体基因表达谱高度相似（皮尔逊相关系数≥0.99）。基因集富集分析显示，A7中与三胚层发育相关的基因集未受显著影响，而B2中这些基因集显著下调，提示其分化潜能可能受损。 * 长期培养稳定性：将克隆A7从第15代培养至第25代（在常氧和低氧条件下），再次进行WGS和RNA-Seq。结果未发现新的CNV、致病性编码变异或结构变异，转录组也保持高度稳定，表明A7在体外长期培养中能维持遗传和转录组的稳定性。
6. 体外免疫原性测试 这是验证“低免疫原性”的核心环节。研究采用了两种体外共培养模型，避免了物种差异带来的问题。 * 模型一：异源CD4⁺ T细胞增殖试验 * 供体选择：选择HLA类型与YIP3完全不同的健康供者A的PBMC。 * 实验设计：将CFSE标记的供者CD4⁺ T细胞，与经IFN-γ预刺激2天的YIP3、A7或B2细胞共培养（同时加入去除T细胞的PBMC作为抗原呈递细胞）。 * 检测指标：在共培养第7、14、21天，通过流式细胞术检测中央记忆性T细胞（Tcm）和效应记忆性T细胞（Tem）的增殖情况。 * 结果：共培养21天后，针对YIP3刺激，CD4⁺ Tcm和Tem的增殖比例分别达到25.2%和22.7%（均值）。相比之下，针对克隆A7的刺激，Tcm和Tem的增殖比例显著降低，分别为19.3%和17.1%（p<0.05）。克隆B2的降低程度不如A7明显。这证明A7细胞刺激异源T细胞增殖的能力显著减弱。 * 模型二：NK细胞活性试验 * 供体选择：选择另一HLA类型不同的供者B的PBMC，分离出NK细胞并用IL-2激活。 * 实验设计：将激活的NK细胞与经IFN-γ预刺激的YIP3、A7或B2细胞共培养6小时。 * 检测指标：通过流式细胞术检测NK细胞表面脱颗粒标志物CD107a的表达，作为其细胞毒活性的指标。 * 结果：与YIP3共培养后，CD107a⁺ NK细胞比例为6.71%。与克隆A7共培养后，该比例显著降低至1.37%（p<0.01）。这表明保留HLA-C的A7细胞能有效减弱NK细胞的攻击活性。
7. 分化细胞中的HLA表达验证 为确认基因编辑效果在分化后的功能细胞中是否持续，研究将A7细胞分化为特定细胞类型（内皮细胞、感觉神经元、肝细胞）并进行验证。 * 分化能力：A7细胞能高效分化为内皮细胞（CD31⁺VE-cadherin⁺细胞比例达91.9%），并表达感觉神经元和肝细胞的特异性标志物，证明其多能性未受损。 * HLA表达：Western Blot和qRT-PCR分析证实，在IFN-γ刺激下，从A7分化而来的内皮细胞和肝细胞中，HLA-A和HLA-B蛋白或mRNA表达依然缺失或显著降低，而HLA-C表达正常。RNA-Seq分析也显示，A7来源的肝细胞中，三个靶基因的表达持续下调。
本研究通过一系列严谨的实验，逐步筛选并验证了一个理想的低免疫原性iPS细胞克隆A7： 1. 成功设计并筛选出高效gRNA，能够在杂合HLA基因型的iPS细胞中实现多基因编辑。 2. 获得并筛选出三基因敲除克隆A7，其基因型明确，编辑位点产生移码突变，导致基因功能丧失。 3. 克隆A7保持了完整的多能性，包括正确的形态、多能性标志物表达和三胚层分化潜能。 4. 在mRNA和蛋白水平证实了HLA-A、-B、-DR的成功敲除，特别是在IFN-γ刺激的严格条件下，这些分子不再表达，而未编辑的HLA-C正常表达。 5. 全面的遗传学分析表明克隆A7基因组稳定，无明显脱靶效应或有害突变，且长期培养中保持稳定。 6. 关键的体外免疫原性试验证明，克隆A7能显著减弱异源CD4⁺ T细胞（包括Tcm和Tem）的增殖反应，并降低NK细胞的细胞毒活性，从而在功能上证实了其“低免疫原性”。 7. 基因编辑效果在分化为功能细胞后依然保持，确保了其作为治疗用细胞来源的潜在安全性。
这些结果环环相扣：基因型确认是基础，多能性验证确保其“干细胞”本质未变，HLA表达分析直接证明编辑效果，遗传稳定性评估保障其应用安全，免疫原性测试则是核心的功能性验证，最终的分化验证表明该策略适用于生产治疗所需的终末细胞。
本研究成功利用CRISPR-Cas9技术，在杂合HLA基因型的iPS细胞中，实现了对HLA-A、HLA-B和HLA-DRA基因的特异性、高效敲除，最终筛选出克隆A7。该克隆不仅保留了iPS细胞的核心特性（多能性与分化潜能），而且在遗传学上稳定，更重要的是，在体外功能实验中表现出显著的免疫逃避特性，能有效减弱T细胞和NK细胞的免疫应答。
科学价值： 1. 技术创新：证明了在杂合HLA背景下，使用共同gRNA对多个高多态性基因进行同步有效敲除的可行性。 2. 策略新颖：采用敲除*HLA-DRA*（而非常见的*DRB1*）来破坏整个HLA II类分子结构，为彻底消除II类分子表达提供了新思路。 3. 验证体系完善：建立了一套从基因编辑、克隆筛选、多方位质量检测（包括IFN-γ刺激下的蛋白检测）到功能性免疫原性评估的完整工作流程和质量控制标准，为未来开发临床级通用型iPS细胞提供了重要方法论参考。
应用价值： 1. 推动通用型细胞治疗：克隆A7这类“低免疫原性”iPS细胞有望作为“通用供体”，分化成各种所需的细胞类型（如心肌细胞、神经元、胰岛β细胞等），用于治疗多种疾病，而无需担心严重的免疫排斥，也无需进行繁琐的HLA