本研究由山西医科大学口腔医学院的秦丹蕾（Danlei Qin）、赵斌（Bin Zhao）等作者团队完成，并发表在期刊 Journal of Nanobiotechnology (2025, 23:360)。这是一项关于开发新型纳米复合水凝胶用于促进糖尿病感染性伤口愈合的原创性研究。
本研究属于生物医学工程、纳米生物技术和伤口修复交叉领域。糖尿病伤口是糖尿病严重的并发症之一，其愈合困难主要归因于持续的高血糖微环境，这会引发一系列恶性循环：为细菌增殖提供过量营养，导致持续感染和炎症反应；引发氧化应激，导致内皮细胞线粒体功能障碍和细胞凋亡，抑制成纤维细胞迁移与增殖，最终造成血管功能失调、再生不良，伤口处于缺血缺氧状态，愈合延迟。因此，重塑高糖和持续性炎症微环境，同时抑制细菌感染并促进血管生成，是加速糖尿病伤口愈合的关键挑战。目前，单一的治疗方式难以应对这一复杂问题，迫切需要开发多功能的生物材料来挽救高血糖微环境中受损的细胞功能。
近年来，多功能水凝胶因其在药物递送、抗炎和抗菌方面的能力受到广泛关注。基于此，本研究旨在开发一种能够调节亚细胞（线粒体）和细胞功能，以加速糖尿病感染伤口愈合的新型水凝胶。其核心策略是结合三种活性成分：黄芩素（Baicalein, Ba，一种具有抗氧化、抗炎特性的黄酮类化合物）、葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOx，可催化葡萄糖消耗并产生过氧化氢）和锌基金属有机框架（ZIF-8，可作为药物载体并在酸性环境下分解释放锌离子）。通过将它们整合到基于甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的可注射光交联水凝胶中，构建一个集葡萄糖调节、抗菌、抗炎、抗氧化和促血管生成于一体的协同治疗平台。
本研究设计严谨，流程完整，主要包含以下几个关键步骤：
1. 纳米颗粒及复合水凝胶的制备与表征 * 研究样本/材料：ZIF-8纳米颗粒、负载黄芩素(Ba)的Ba@ZIF-8、负载黄芩素和葡萄糖氧化酶的Ba/GOx@ZIF-8 (BGZ) 纳米颗粒，以及由它们与GelMA复合制备的水凝胶（分别命名为Z@GelMA, BZ@GelMA, BGZ@GelMA）。 * 实验处理与表征方法：首先，采用共沉淀法合成了ZIF-8纳米颗粒，并通过物理吸附分别负载Ba和GOx。接着，通过光引发剂（LAP）和可见光（405 nm）照射，将纳米颗粒分散在GelMA前体溶液中交联形成水凝胶。利用扫描电子显微镜（SEM）观察了纳米颗粒和水凝胶的形貌与多孔结构。通过X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了纳米颗粒的晶体结构和化学官能团，证实了Ba和GOx的成功负载。使用动态光散射和Zeta电位仪测量了纳米颗粒的尺寸和电位。通过核磁共振氢谱（1H NMR）确认了GelMA的成功合成（出现了甲基和乙烯基质子信号）。此外，还通过挤出实验验证了水凝胶的可注射性。
2. 体外生物相容性评估 * 研究样本：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和小鼠成纤维细胞（L929细胞），以及不同浓度的纳米复合水凝胶或其提取物。 * 实验设计与方法：在体外，通过向培养基中添加脂多糖（LPS）和高浓度葡萄糖（33 mM）来模拟糖尿病伤口的高糖炎症微环境（HL环境）。 * 细胞毒性：使用CCK-8法评估了不同浓度纳米颗粒对HUVECs活力的影响，确定了安全浓度范围。随后，在HL环境下，将细胞与不同水凝胶提取物共培养1、3、5天，通过CCK-8法检测细胞增殖。 * 细胞存活与凋亡：通过钙黄绿素/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）活死细胞染色观察共培养3天后HUVECs和L929的存活状态。使用膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒结合流式细胞术分析HUVECs的凋亡率。 * 细胞增殖验证：采用EdU（5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷）掺入实验和Ki-67免疫荧光染色，特异性检测HUVECs中新合成的DNA和增殖细胞核抗原，定量分析细胞增殖水平。 * 血液相容性：通过溶血实验评估了水凝胶与红细胞的相容性。
3. 体外抗菌活性评估 * 研究样本：金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）和大肠杆菌（*Escherichia coli*）作为代表性细菌模型，以及不同组别的水凝胶。 * 实验设计与方法： * 菌落计数法：将细菌悬液与水凝胶共培养24小时后，稀释涂板，计数菌落形成单位，计算抑菌率。 * 细菌活死染色：使用SYTO 9/PI试剂盒对共培养后的细菌进行染色，在共聚焦显微镜下观察活菌（绿色）和死菌（红色）的比例。 * 细菌形态观察：通过SEM观察经水凝胶处理后细菌细胞膜的完整性是否被破坏（如收缩、破裂、内容物泄漏）。 * 抗菌机制初探：通过结晶紫染色评估水凝胶对细菌生物膜的抑制作用；通过流式细胞术检测细菌对碘化丙啶（PI，只能进入膜损伤细胞）的摄取率，验证Zn²⁺和Ba对细菌细胞膜的损伤作用。
4. 细胞与线粒体功能保护及活性氧清除作用评估 * 研究样本：在HL环境下培养的HUVECs，以及不同水凝胶提取物。 * 实验设计与方法： * 细胞内及线粒体活性氧检测：使用DCFH-DA探针检测细胞质内总活性氧（ROS）水平；使用MitoSOX Red探针（结合MitoTracker Green线粒体定位）特异性检测线粒体内活性氧（mtROS）水平，通过荧光显微镜观察并定量荧光强度。 * 线粒体膜电位检测：使用JC-1探针评估线粒体膜电位（ΔΨm）。正常膜电位下，JC-1形成聚合物（J-aggregates）发出红色荧光；膜电位下降时，JC-1以单体形式存在发出绿色荧光。通过红绿荧光比值的变化来评估线粒体功能状态。
5. 细胞迁移与血管生成能力评估 * 研究样本：HL环境下的HUVECs和L929细胞。 * 实验设计与方法： * 细胞划痕实验：在单层细胞上制造划痕，与不同水凝胶提取物共培养24小时，观察并计算细胞迁移覆盖的划痕面积百分比。 * Transwell迁移实验：将细胞接种于上室，下室为含不同水凝胶提取物的培养基，培养24小时后，固定染色下室迁移过来的细胞，计数。 * 体外血管形成实验：将HUVECs接种于铺有Matrigel的孔板中，在含不同水凝胶提取物的培养基中培养6小时，观察并量化细胞形成的管状网络结构（节点数）。 * 血管生成相关因子表达：通过免疫荧光染色检测HUVECs中血管内皮生长因子（VEGF）和CD31的表达水平；通过蛋白质印迹（Western Blot, WB）定量分析VEGF的蛋白表达量。
6. 转录组测序探索作用机制 * 研究样本：在HL环境下，经BGZ@GelMA处理与未经处理的HUVECs。 * 实验设计与方法：对两组细胞进行全转录组测序（RNA-seq）。通过主成分分析（PCA）评估样本差异，通过火山图筛选差异表达基因（DEGs）。对DEGs进行基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以揭示BGZ@GelMA调控的生物学过程和关键信号通路。
7. 体内糖尿病伤口愈合评估 * 研究样本/对象：雄性Sprague-Dawley大鼠，通过注射链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病模型。在每只大鼠背部制作一个直径20 mm的全层皮肤伤口。将大鼠随机分为三组：空白对照组（不做处理）、GelMA水凝胶组、BGZ@GelMA水凝胶组，每组6只。 * 实验设计与方法： * 伤口愈合进程监测：在术后第0、5、10、14、21天拍照记录伤口，并使用ImageJ软件定量计算伤口闭合率。 * 组织学分析：在第7天和21天取伤口组织。 * 苏木精-伊红（H&E）染色：评估炎症细胞浸润、上皮再生和伤口裂隙长度。 * Masson三色染色：评估胶原纤维的沉积和排列（蓝色部分），反映组织成熟度。 * 免疫组织化学染色：检测伤口组织中炎症因子（IL-6, TNF-α）和血管生成相关标志物（VEGF, CD31）的表达水平，并进行阳性区域定量分析。 * 安全性评估：对主要器官（心、肝、脾、肺、肾）进行H&E染色，评估水凝胶的全身生物安全性。
8. 数据分析方法 所有定量数据均以平均值±标准差表示，至少进行三次独立重复实验。使用GraphPad Prism 8.0和Origin软件进行统计分析和作图。两组间比较采用Student-t检验；多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并辅以Tukey多重比较检验。统计显著性设定为：*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。
1. 材料成功制备与表征：成功合成了尺寸约150-180 nm、形貌规整的ZIF-8及其负载型纳米颗粒（Ba@ZIF-8, BGZ）。FTIR和XRD证实了Ba和GOx的负载未破坏ZIF-8的晶体结构。成功合成了GelMA，并制备出具有三维多孔网络结构的可注射光交联纳米复合水凝胶，这种结构有利于细胞迁移和气体交换。
2. 优异的生物相容性：在安全浓度下，纳米复合水凝胶在HL环境下对HUVECs和L929细胞无明显毒性。与HL对照组相比，水凝胶处理组细胞存活率更高，凋亡率显著降低。其中，BGZ@GelMA组促进细胞增殖的效果最为显著（EdU阳性细胞比例最高，Ki-67表达上调）。溶血率极低（约0.7%），表明其具有良好的血液相容性。
3. 强大的广谱抗菌能力：BGZ@GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出接近100%的抑菌率（分别为95.3%和97.6%），显著优于单一成分的水凝胶组。细菌活死染色和SEM观察显示，BGZ@GelMA处理导致大量细菌死亡，菌体膜结构严重受损。机制研究发现，Zn²⁺和Ba可协同破坏细菌细胞膜（PI摄取率增加），并能有效抑制细菌生物膜形成。
4. 有效清除活性氧并恢复线粒体功能：在HL环境下，HUVECs内及线粒体内的ROS水平异常升高，线粒体膜电位显著下降（JC-1红色荧光减弱）。经BGZ@GelMA处理后，细胞内和线粒体内的ROS荧光强度降至最低水平，同时线粒体膜电位得到显著恢复（JC-1红/绿荧光比值最高），表明该水凝胶能有效缓解氧化应激，保护线粒体功能和能量代谢稳态。
5. 显著促进细胞迁移与血管生成：划痕实验和Transwell实验表明，在HL环境下，BGZ@GelMA能最有效地促进HUVECs和L929细胞的迁移。体外血管形成实验显示，BGZ@GelMA处理组HUVECs形成了更密集、节点更多的管状网络结构。免疫荧光和WB结果证实，BGZ@GelMA能显著上调HUVECs中促血管生成因子VEGF和CD31的表达。这些结果为体内促愈合效果奠定了基础。
6. 转录组测序揭示潜在机制：RNA-seq分析发现，BGZ@Gelma处理引起了HUVECs中235个基因的差异表达。KEGG通路富集分析将焦点指向了过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路。已知PPAR家族（尤其是PPARγ）参与调控线粒体代谢、炎症反应、细胞增殖和存活，其激活可以抑制NF-κB等促炎通路。这提示BGZ@Gelma，特别是其中的黄芩素（Ba），可能通过调节PPAR等通路来发挥其线粒体保护、抗炎和促修复作用。
7. 高效促进糖尿病伤口体内愈合： * 愈合速度：与空白对照组和GelMA组相比，BGZ@GelMA组大鼠的伤口闭合速度最快，在第21天愈合率高达98.5%。 * 炎症缓解：第7天H&E染色和免疫组化显示，BGZ@GelMA组伤口炎症细胞浸润显著减少，促炎因子IL-6和TNF-α的表达水平明显降低。 * 组织再生与血管生成：第21天Masson染色显示BGZ@GelMA组胶原沉积更丰富、排列更有序。第14天免疫组化显示，该组伤口组织中VEGF和CD31的阳性表达面积最大，表明新生血管形成活跃。 * 安全性：主要器官H&E染色未发现明显病理损伤，证明该水凝胶具有良好的体内安全性。
本研究成功开发了一种多功能、可注射的光交联纳米复合水凝胶（BGZ@GelMA），它能通过多靶点协同作用，有效加速糖尿病感染性伤口的愈合。其作用机制可以概括为：首先，水凝胶中的GOx响应伤口局部高血糖，催化消耗葡萄糖并产生H₂O₂，降低局部pH值，从而重塑伤口微环境。酸性环境触发ZIF-8分解，持续释放Zn²⁺和黄芩素（Ba）。Zn²⁺和Ba协同发挥强大的抗菌作用。更重要的是，释放的Ba能有效清除细胞和线粒体内的过量ROS，恢复线粒体膜电位和功能稳定性，从根本上改善高血糖诱导的细胞功能损伤。同时，Zn²⁺和Ba还能协同促进内皮细胞增殖、迁移和血管生成相关因子（如VEGF）的表达。最终，在抗菌、抗炎、抗氧化和保护线粒体的共同作用下，糖尿病伤口实现快速愈合。
研究团队在讨论部分也客观指出了本工作的局限性，例如：对纳米材料合成浓度、水凝胶交联参数（如时间、光强）的优化缺乏系统研究；主要关注了GOx对局部血糖的调节，未深入探讨其对全身血糖的潜在影响。这些为后续研究的深入指明了方向。此外，补充实验还初步证实了该水凝胶体系对于晚期糖基化终末产物（AGEs）刺激引起的炎症和细胞迁移抑制也有改善作用，进一步拓宽了其应用潜力。
总而言之，这项研究为糖尿病慢性伤口的治疗提供了一种在亚细胞和细胞功能水平上发挥作用的新型多功能水凝胶策略，具有重要的科学意义和广阔的临床转化前景。