关于VISTA通过调节ACOD1/衣康酸代谢减轻脑缺血再灌注后小胶质细胞介导的神经炎症的研究报告

本研究由哈尔滨医科大学第一附属医院神经内科的孙一蕾、刘丹、刘艳臣及迟立君共同完成。研究成果发表于2025年的学术期刊《Molecular Neurobiology》第62卷。

一、 研究的学术背景

本研究聚焦于急性缺血性脑卒中（Acute Ischemic Stroke, AIS）后一个关键的继发性损伤过程——脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemia–Reperfusion Injury, CIRI）。尽管及时的血流再通是治疗AIS的首要目标，但再灌注本身会引发复杂的病理级联反应，其中神经炎症扮演了核心角色。小胶质细胞作为大脑常驻的免疫细胞，在CIRI中被迅速激活，其功能状态（促炎的M1型或抗炎的M2型极化）深刻影响着神经损伤与修复的平衡。因此，靶向调控小胶质细胞的炎症反应是潜在的神经保护策略。

免疫检查点分子是调控免疫反应强度的“刹车”系统。VISTA（V-type immunoglobulin domain–containing suppressor of T cell activation，即V型免疫球蛋白域T细胞激活抑制因子）是一种主要在髓系细胞和T细胞上表达的抑制性免疫检查点。前期研究表明，VISTA在神经炎症（如多发性硬化）过程中表达下降，并能负向调节小胶质细胞的糖酵解和激活。然而，VISTA在CIRI中的具体作用及其机制尚不明确。

另一方面，细胞代谢重编程是免疫细胞功能调控的新兴前沿领域。三羧酸（Tricarboxylic Acid, TCA）循环是核心的葡萄糖代谢途径。衣康酸（Itaconate, Ita）是由乌头酸脱羧酶1（Aconitate Decarboxylase 1, ACOD1，亦称IRG1）催化产生的TCA循环代谢中间物，被证实具有显著的抗炎作用。有趣的是，既往研究提示VISTA可能通过ACOD1介导巨噬细胞的重编程。

基于以上背景，本研究旨在探究以下科学问题：在CIRI中，VISTA的表达有何变化？上调VISTA是否能发挥神经保护作用？其保护作用是否通过调控小胶质细胞的ACOD1/衣康酸代谢及相关信号通路来实现？研究的目标是阐明VISTA在CIRI中的分子机制，为开发基于免疫代谢调控的卒中治疗新策略提供理论依据。

二、 详细研究流程

本研究采用生物信息学分析、体内动物模型和体外细胞模型相结合的多层次策略，流程严谨且系统。

1. 关键基因的筛选与验证： * 研究对象与样本量： 从基因表达综合数据库（GEO）下载数据集GSE77986，该数据集包含5只短暂性大脑中动脉闭塞（Transient Middle Cerebral Artery Occlusion, tMCAO）模型小鼠和3只假手术小鼠的小胶质细胞基因表达数据。 * 研究流程： 首先，利用limma包进行差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）分析，在tMCAO与假手术组间共鉴定出3294个DEGs。随后，将47个人类免疫检查点基因转换为41个小鼠同源基因，并与上述DEGs取交集，最终筛选出8个差异表达的免疫检查点基因。其中，编码VISTA的基因 Vsir 表达下调且变化最为显著，因此被选定为后续研究的核心靶点。 * 验证实验： 通过建立小鼠tMCAO模型（缺血1小时），在再灌注后1、3、7天收集梗死周边脑组织。采用蛋白质印迹（Western Blot, WB）、定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）、免疫组织化学和免疫荧光等技术，在蛋白和mRNA水平上证实了VISTA在CIRI后（尤其是第3天）的表达显著下降，且其主要由小胶质细胞表达。

2. VISTA在CIRI中保护作用的体内验证： * 动物模型与分组： 使用雄性C57BL/6小鼠构建tMCAO模型。实验分为四组：假手术组、tMCAO模型组、tMCAO + VISTA过表达组、tMCAO + 空载体对照组。VISTA过表达通过向 *Cx3cr1*cre小鼠（小胶质细胞特异性表达Cre重组酶）侧脑室注射携带 Vsir 基因的AAV病毒（AAVmg1.2-vsir）实现，利用Cre-loxp系统实现小胶质细胞特异性的VISTA上调。 * 研究方法与评估指标： 在造模后第5天进行评估。① 神经功能缺损： 采用Longa评分量表。② 梗死体积： 通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色（TTC Staining）量化。③ 组织病理学： 进行苏木精-伊红（H&E）染色和尼氏（Nissl）染色，评估神经元坏死和结构破坏。④ 炎症因子与细胞极化： 采用WB和qRT-PCR检测促炎因子（IL-6, TNF-α, IL-1β）和抗炎因子（IL-10）的表达水平；通过免疫荧光共标（Iba1/CD16, Iba1/CD206）观察小胶质细胞向M1或M2型的极化情况。

3. VISTA对小胶质细胞功能的体外机制探究： * 细胞模型： 使用小鼠BV2小胶质细胞系，建立氧糖剥夺/复氧模型以模拟体外缺血再灌注。 * 研究流程： * 验证VISTA变化： 检测不同时长OGD（2、4、6小时）后复氧24小时，VISTA的表达变化。 * 功能验证： 将 Vsir 过表达质粒转染BV2细胞，然后在OGD/R条件下培养。评估指标包括：炎症因子表达（WB, qRT-PCR）、细胞增殖能力（CCK-8法、EdU染色）。 * 机制探索 - 转录组学分析： 对细胞进行分组（对照组、OGD/R组、VISTA过表达+OGD/R组），提取总RNA进行RNA测序。通过差异表达分析、基因本体论（GO）富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析和基因集富集分析（GSEA），寻找VISTA下游的关键通路和基因。分析发现，ACOD1是VISTA调控的关键差异基因，且NF-κB信号通路显著富集。 * 机制探索 - 代谢物检测： 使用酶联免疫吸附试验（ELISA）和酶标仪检测TCA循环关键中间产物（柠檬酸、异柠檬酸、顺乌头酸、衣康酸）的浓度。 * 机制验证 - 关键通路确认： 为了证实ACOD1在VISTA作用中的必要性，研究者设计了挽救实验。在过表达VISTA的同时，使用小干扰RNA（siRNA）敲低ACOD1的表达。然后检测：① ACOD1和VISTA的蛋白水平（WB）；② NF-κB通路关键蛋白（p-IκBα, IκBα, p-p65, p65）的磷酸化水平（WB）；③ 炎症因子表达（qRT-PCR）；④ 细胞增殖（CCK-8, EdU）。

三、 主要研究结果

1. VISTA在CIRI后表达下调，且与神经损伤相关： 生物信息学分析和体内外实验一致证实，在tMCAO小鼠的梗死周边区和OGD/R处理的BV2细胞中，VISTA蛋白和mRNA水平均显著降低。免疫荧光显示VISTA主要与小胶质细胞共定位，且在梗死核心区下降更明显。这提示VISTA的缺失可能与CIRI的病理过程相关。

2. 上调VISTA可显著减轻CIRI并抑制小胶质细胞介导的炎症：

   • 体内结果： 与tMCAO模型组相比，小胶质细胞特异性过表达VISTA能显著改善小鼠的神经功能评分（Longa评分降低）、减小脑梗死体积、减轻脑组织病理损伤（H&E和Nissl染色显示神经元结构改善）。同时，VISTA过表达降低了促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β的水平，提升了抗炎因子IL-10的水平。免疫荧光结果显示，VISTA减少了促炎M1型（Iba1+CD16+）小胶质细胞的数量，增加了抗炎M2型（Iba1+CD206+）的数量。
   • 体外结果： 在BV2细胞中过表达VISTA，同样能抑制OGD/R诱导的促炎因子升高和IL-10降低，并显著抑制小胶质细胞的过度增殖。

3. VISTA通过上调ACOD1重塑小胶质细胞TCA循环代谢： RNA-seq分析表明，VISTA调控的差异基因显著富集于葡萄糖代谢等过程，其中ACOD1是受VISTA正向调控最显著的基因之一。WB和qRT-PCR证实VISTA过表达能上调ACOD1的蛋白和mRNA水平。代谢物检测进一步发现，VISTA改变了TCA循环流量：降低了柠檬酸和异柠檬酸的浓度，同时提高了顺乌头酸和终产物衣康酸的产量。这表明VISTA促进了ACOD1的催化活性，引导代谢流向衣康酸合成。

4. VISTA通过ACOD1抑制IκBα/NF-κB信号通路发挥保护作用： RNA-seq的GSEA和KEGG分析均提示NF-κB通路参与其中。WB实验证实，OGD/R激活了IκBα/NF-κB通路（表现为IκBα和p65的磷酸化增强），而VISTA过表达能有效抑制该通路的活化。最关键的结果来自挽救实验： 当使用siRNA敲低ACOD1后，VISTA对IκBα/NF-κB通路的抑制作用被完全取消。同时，VISTA原本具备的抑制促炎因子表达、提升IL-10水平以及抑制细胞增殖的保护效应也全部被逆转。这直接证明了ACOD1是VISTA行使功能不可或缺的下游效应分子。

四、 研究结论与意义

本研究得出结论：在脑缺血再灌注损伤中，抑制性免疫检查点分子VISTA的表达下降。通过病毒或质粒手段在体内外特异性上调小胶质细胞的VISTA表达，能够通过促进ACOD1的表达和衣康酸的合成，重塑小胶质细胞的TCA循环代谢，进而抑制关键的促炎信号通路IκBα/NF-κB的活化，最终减轻神经炎症、抑制小胶质细胞过度增殖、改善神经功能缺损并缩小梗死体积。

研究的科学价值在于： 1. 机制创新： 首次将“免疫检查点（VISTA）”与“免疫代谢（ACOD1/衣康酸）”这两个前沿领域在CIRI的语境下联系起来，阐明了“VISTA-ACOD1-衣康酸-IκBα/NF-κB”这一全新的神经保护信号轴，为理解CIRI的免疫代谢调控提供了新的理论框架。 2. 治疗靶点发现： 明确了VISTA和ACOD1作为减轻卒中后神经炎症的潜在治疗靶点。鉴于免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中的巨大成功，靶向VISTA等抑制性检查点以“释放”内源性抗炎机制，为卒中治疗提供了新的药物研发思路。 3. 研究范式： 综合运用生物信息学、体内基因编辑动物模型、体外细胞模型、多组学（转录组、代谢组）分析和严谨的遗传学挽救实验，构成了一个完整且逻辑闭环的机制研究范式。

五、 研究亮点

1. 研究视角新颖： 聚焦于免疫检查点分子对脑内固有免疫细胞（小胶质细胞）代谢的重编程作用，选题处于神经科学、免疫学和代谢学的交叉前沿。
2. 证据链完整坚实： 从临床数据库分析到动物、细胞模型，从表型观察到机制挖掘，从相关性证明到因果性验证（ACOD1敲低挽救实验），层层递进，论证严密。
3. 技术手段先进全面： 采用了小胶质细胞特异性Cre工具鼠、颅内病毒注射、RNA-seq等高通量筛选技术，以及针对特定代谢物的精准检测，确保了研究的深度和可靠性。
4. 转化潜力明确： 研究不仅揭示了基础机制，更直接指向了VISTA和ACOD1/衣康酸通路作为卒中治疗新策略的转化医学潜力。

六、 其他有价值的内容

作者在讨论部分也客观指出了本研究的局限性：VISTA在中枢神经系统内的配体尚未被充分研究，这对于未来开发靶向VISTA的激动剂或抗体药物至关重要，是后续研究的重要方向。此外，研究主要关注了急性期的保护效应，VISTA对卒中长期恢复（如神经再生、突触重塑）的影响值得进一步探索。