全球人类转录因子足迹参考图谱
主要作者为Jeff Vierstra和John A. Stamatoyannopoulos，二人均隶属于美国华盛顿州西雅图的Altius Institute for Biomedical Sciences；其中John Lazar和Wouter Meuleman亦对该研究有重要贡献。该研究发表于Nature杂志第583卷，2020年7月30日刊出，在线发表日期为2020年7月29日。
这项研究属于基因调控与功能基因组学领域。转录因子（transcription factors, TFs）与调控DNA的组合式结合是所有生物基因调控的基础。尽管调控区的遗传变异已与多种疾病和表型性状相关联，但如何从海量变异中准确识别真正影响调控功能的位点，一直是该领域的核心难题。基因组DNase I足迹分析（DNase I footprinting）能够在天然染色质环境下以单核苷酸分辨率描绘转录因子占据位点，但此前仅有一小部分此类位点在人类基因组上被精确解析。因此，研究者旨在通过大规模数据整合，构建一个全面的人类转录因子足迹参考图谱，为基因调控机制解析和功能遗传变异研究提供框架。
为了实现这一目标，研究团队采集并测序了来自243个人类细胞与组织类型及状态的高质量、高复杂度DNase I文库，包括151个原代细胞与组织、22个培养原代细胞、10个永生化细胞系以及60个癌细胞系与原代样本。所有样本共获得676亿个唯一比对的DNase I切割事件，平均每个生物样本约2.782亿个。研究者开发了一种计算流程，将染色质结构与经验性的DNase I序列偏好相结合，为每个生物样本建立统计模型，检测单个核苷酸上观察到的切割率是否显著偏离预期值。利用该模型，在每个样本中独立进行从头（de novo）足迹发现，平均每个样本检测到657,029个高置信度足迹，合计达到1.596亿个足迹事件。
为了进一步整合这数百个足迹数据集并提高分辨率，研究者实现了经验贝叶斯框架，通过整合先验足迹存在概率与切割率似然模型，估计每个核苷酸被足迹覆盖的后验概率。他们将该方法应用于全部243个样本中检测到的DNase I高敏感位点（DNase I hypersensitive sites, DHSs），并沿用建立共识DHS索引的策略，将重叠的足迹区域整合为高分辨率共识足迹（consensus footprints）。最终在约160万个DHS内（占全部339万个DHS的46%）界定了约446万个共识足迹。共识足迹平均宽度为16 bp，82.6%直接位于DHS核心区域。由于足迹检测对测序深度和样本多样性存在依赖，研究者通过子采样分析表明，增加测序深度可线性提高足迹检测数量，而增加新样本则带来亚线性增长，提示当前共识足迹空间可能已覆盖大部分跨细胞和组织共享的转录因子结合位点。
在将转录因子分配到足迹的过程中，研究者汇集并聚类了所有公开可用的基序模型（motif models），构建了非冗余的转录因子原型（archetypes），并在高严格度条件下将其比对到人类参考基因组上。最终80.7%的共识足迹可被分配给至少一个转录因子，其中19.3%可明确分配给单一因子。为评估映射准确性，研究者以CTCF为基准，利用ENCODE ChIP–seq数据验证足迹分类性能，平均精度-召回曲线下面积达0.80，在阈值下正确识别平均每个细胞类型19,904个CTCF结合元件，平均精确度为82.5%，灵敏度为60%。
关于调控区的初级结构，研究团队发现足迹宽度与转录因子识别序列宽度高度相关（Spearman’s ρ=0.90）。以CTCF为例，足迹的每核苷酸切割模式能够精确描绘蛋白质-DNA相互作用界面的所有拓扑特征，包括锌指7与9之间铰链区的局灶性超敏感现象。对PAX6等不同类型的DNA结合结构域也获得了类似结果。进一步分析显示，仅有8%的足迹包含多个转录因子识别位点，92%的足迹为单一转录因子占据；在最深采样DHS中，足迹密度平均为每200 bp约5.5个，边缘间距平均约21 bp。该结果表明，稳态调控DNA的可及性主要由独立但协同的转录因子结合模式维持，而非依赖转录因子间的直接协同相互作用。
在细胞选择性转录因子占据方面，研究者识别出609个与足迹序列匹配的基序模型，涵盖64种原型识别代码。对于同源序列被多个转录因子识别的简并基序，观察到高度细胞选择性的占据模式，可分解为与细胞类型和功能相符的连贯分组。对神经谱系的系统分析显示，在67,368个在神经与非神经样本中均高度可及的DHS中，仅2.5%（1,720个）包含一个或多个差异足迹元件；差异占据的足迹显著富集REST、NFIB、ZIC1和EBF1等已知神经系统调控因子的识别位点。综合结果表明，绝大多数DHS标记的调控DNA区域编码单一结构拓扑，仅在少数元件中DHS作为细胞背景特异性转录因子占据的支架。
在功能遗传变异方面，243个生物样本共来自147个个体，从头基因分型在DHS内发现了376万个单核苷酸变异（single-nucleotide variants, SNVs），其中1,656,597个为杂合子且具有足够读取深度用于等位基因不平衡定量。研究者保守地鉴定了117,626个染色质改变变异（chromatin-altering variants, CAVs），这些变异在单个等位基因上改变DNA可及性，中位不平衡倍数为2.4倍。在DHS内部，CAVs显著富集于核心共识足迹中。出乎意料的是，CAVs在功能丧失（loss-of-function，结合破坏）与功能获得（gain-of-function，结合增强或从头结合）等位基因之间近乎均匀分配。杂合子与纯合子的分析结果互相印证，且等位基因比例与相对足迹强度之间高度一致。变异在足迹化基序内显著富集于高信息含量位置，并与预测的转录因子结合位点能量效应相平行。
关于人类遗传变异在足迹中的分布，仅11.6%的个体足迹显示出进化约束证据（phyloP评分>1），绝大多数似乎为中性进化。利用TOPMed项目中超过65,000个个体的全基因组测序数据，研究者计算了共识足迹内的平均核苷酸多样性（π），发现其接近蛋白质编码区四倍简并位点的水平。令人意外的是，足迹核心内核苷酸多样性精确升高，并在极低等位基因频率变异（MAF<0.0001）中同样观察到类似模式，提示足迹区域突变负荷增加。通过7-mer序列上下文突变率模型，该突变密度几乎完全被重现，表明足迹突变负荷主要源于局部序列组成，特别是转录因子倾向识别含CpG二核苷酸等超变序列，而非DNA修复受到抑制所致。进化约束足迹与非约束足迹之间存在显著差异：约3–5倍的进化约束差异表明，核心结合位点集受到较强纯化选择，但绝大多数足迹处于非常弱的选择约束下。足迹内的超突变可能通过促进转录因子占据变异，在调控进化中发挥重要作用。
在全基因组关联研究（GWAS）变异定位方面，研究者发现DHS内聚集的GWAS目录单核苷酸多态性（SNPs）富集于足迹而非非足迹亚区，且富集度随足迹强度单调增加。分区LD评分回归分析显示，足迹中的SNP遗传力贡献普遍超过5倍富集，在认知细胞类型中最高可达约45倍富集。因此，疾病和性状相关变异在调控DNA中的遗传信号绝大部分源自转录因子足迹。
该研究的主要结论如下：研究团队构建了迄今分辨率最高的人类基因组调控因子占据图谱，定义了约450万个组成调控DNA基本单元的基因组序列元件。尽管该目录因细胞类型和测序深度限制而并非完全穷尽，但已提供了一个可扩展的核苷酸精度参考框架。该研究发现DHS中的遗传关联与遗传力信号压倒性地集中于共识转录因子足迹，极大促进了疾病相关变异与基因组功能的关联分析。更为重要的是，该研究揭示人类遗传变异本身即富集于转录因子足迹内，其机制源于突变倾向与人类转录因子识别的超变核苷酸组合（如CpG二核苷酸）的共同作用。由于人类与小鼠转录因子共享大部分识别景观，这种变异集中可能在塑造哺乳动物调控中发挥了重要作用，并提示基因组在很大程度上已为调控进化做好了准备，为表型进化的促进机制提供了可能的分子基础。
该研究的亮点在于：第一，通过整合243个样本的676亿个DNase I切割事件，建立了全球最大的人类转录因子足迹参考图谱；第二，开发了经验贝叶斯计算框架，极大提高了足迹检测的精度和可重复性；第三，首次系统证明DHS内遗传关联信号几乎全部源自足迹，且功能变异在功能丧失与获得之间近乎均等分配；第四，发现转录因子占据位点是高多态性区域，这种高变异性主要由序列上下文驱动的突变率而非修复抑制所致，从而揭示了一个此前未被充分认识的顺式调控进化驱动因素。