本文属于类型a，即单一原创研究的学术报告。
该研究由内蒙古自治区人民医院神经内科的沈杰、临床医学研究中心的徐桂华，以及日本富山大学医学药学研究部病理学系的笹原正清等学者共同完成。沈杰与笹原正清为共同通讯作者。研究成果于2019年发表在《Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism》第39卷第8期。
研究的学术背景围绕缺血性脑卒中后血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）的修复机制展开。血脑屏障对维持脑内微环境稳态至关重要，其破坏是卒中后脑损伤加重的重要因素。缺血后内皮细胞紧密连接（tight junction, TJ）蛋白紊乱、转胞吞作用增强以及周细胞（pericyte）功能障碍均可导致血管源性脑水肿和出血转化，因此恢复血脑屏障完整性是减轻缺血性脑损伤的重要治疗策略。血小板衍生生长因子受体β（platelet-derived growth factor receptor beta, PDGFR-β）介导周细胞向缺血区域的募集，参与血脑屏障功能恢复，但其具体下游机制尚不清楚。转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）是周细胞来源的可以增强内皮屏障功能的信号分子。基于此，研究旨在探讨PDGFR-β信号是否通过TGF-β信号通路调控缺血后血脑屏障的恢复。
研究流程由体内动物实验和体外细胞实验两大部分构成。在体内实验中，研究者构建了出生后诱导的系统性PDGFR-β基因敲除小鼠（Esr-KO），以PDGFR-β floxed/floxed小鼠（Floxed）作为对照。实验采用光化学法诱导大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）建立局灶性脑缺血模型。动物分组包括Floxed和Esr-KO各73只用于MCAO，各22只用于假手术。在MCAO后第3、6、14天分别检测绝对脑含水量、水肿形成率和水肿占位效应，并通过转角试验和胶带移除试验评价神经功能。Western blot检测缺血侧与对侧皮层中claudin5、occludin、zonula occludens-1（ZO-1）等紧密连接蛋白以及TGF-β、血管生成素1（angiopoietin 1, Ang1）、Tie2、水通道蛋白4（aquaporin 4, AQP4）的表达。免疫荧光染色观察紧密连接蛋白在血管内皮上的分布长度，并通过desmin标记周细胞、glial fibrillary acidic protein（GFAP）标记星形胶质细胞、glucose transporter 1（GLUT1）标记内皮细胞进行共定位分析。透射电子显微镜结合辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）静脉注射用于观察内皮转胞吞囊泡数量和紧密连接超微结构。为验证TGF-β在体内的作用，研究者在MCAO前1天向侧脑室预先给予重组人TGF-β1，随后检测水肿、神经功能和紧密连接蛋白表达。
体外实验采用人脑微血管周细胞（human brain microvascular pericytes, HBMPCs）和人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells, HBMECs）共培养模型。通过Transwell系统构建体外血脑屏障模型，利用PDGFR-β siRNA沉默周细胞中PDGFR-β基因表达。通过定量实时PCR检测沉默效率，MTT法和TUNEL染色检测细胞活力和凋亡。屏障功能通过14C-蔗糖通透性试验评价。实验中进一步设置TGF-β1外源性处理组和TGF-β I型受体抑制剂SB431542处理组，以验证TGF-β信号的作用。为探讨PDGFR-β与TGF-β信号的交叉关系，在缺氧条件下给予外源性PDGF-BB，并联合抗TGF-β1抗体处理，Western blot检测周细胞中p-Smad2/3的表达水平。
研究结果显示，PDGFR-β缺失在小鼠MCAO后第6天显著加重脑水肿形成和水肿占位效应，但在第3天和第14天差异不明显。Esr-KO小鼠在MCAO后第3天至第14天出现更严重的对侧接触时间、对侧移除时间和右转百分比增加，提示感觉运动功能恢复受损。Western blot和免疫荧光分析显示，Esr-KO小鼠缺血侧皮层中claudin5和occludin蛋白表达在第6天显著低于Floxed小鼠，而ZO-1水平两组间无显著差异。电子显微镜观察发现，Esr-KO小鼠第6天缺血边缘区内皮细胞中HRP标记囊泡数量显著增加，基底膜HRP聚集增多，同时紧密连接结构变短、出现间隙且电子密度降低。这些结果说明PDGFR-β缺失不仅导致紧密连接蛋白表达恢复延迟，还加剧了内皮转胞吞作用和紧密连接结构变形。
机制研究发现，Esr-KO小鼠缺血侧皮层TGF-β蛋白表达在MCAO后第3天至第14天均显著低于Floxed小鼠，而Ang1、Tie2和AQP4水平无显著差异。免疫荧光显示TGF-β在desmin阳性血管周细胞中的表达在Esr-KO小鼠中降低，而AQP4和GFAP阳性细胞围绕血管的增生情况在两组间相似。这提示TGF-β可能是PDGFR-β下游的关键效应分子。在体外共培养模型中，与内皮细胞单层相比，周细胞共培养可显著降低14C-蔗糖通透性，表明周细胞增强内皮屏障功能。沉默周细胞PDGFR-β后这一屏障增强作用被完全取消，而外源性TGF-β1可部分恢复屏障功能。SB431542处理可加重屏障损伤，并且在PDGFR-β沉默的共培养模型中进一步增加通透性。PDGF-BB处理可显著增加周细胞中p-Smad2/3水平，抗TGF-β1抗体可部分抑制PDGF-BB诱导的Smad2/3磷酸化。体内实验中，提前给予TGF-β1可显著降低Floxed和Esr-KO小鼠MCAO后第6天的水肿形成率、对侧接触时间和移除时间，并提高claudin5和occludin蛋白表达，但对ZO-1无显著影响。这些结果表明PDGFR-β信号通过促进TGF-β信号进而增强血脑屏障功能。
研究结论认为，PDGFR-β信号通过TGF-β信号通路在缺血性脑卒中后血脑屏障完整性恢复中发挥关键作用。PDGFR-β缺失可导致周细胞来源TGF-β减少，进而抑制紧密连接蛋白claudin5和occludin的恢复，并加重内皮转胞吞和紧密连接结构异常，最终加剧脑水肿和神经功能缺损。外源性TGF-β1可在一定程度上弥补PDGFR-β缺失造成的屏障功能障碍。该研究首次在体内外实验中系统阐明了PDGFR-β与TGF-β在缺血后血脑屏障修复中的交叉调控关系。
研究亮点在于：其一，利用出生后诱导的系统性PDGFR-β敲除小鼠避免了对发育期血管生成的干扰，从而更准确地反映成年脑损伤后PDGFR-β的功能；其二，结合体内脑缺血模型与体外内皮-周细胞共培养模型，从组织、细胞和分子多个层面验证了PDGFR-β/TGF-β信号轴的作用；其三，通过透射电镜结合HRP示踪直观展示了内皮转胞吞和紧密连接超微结构变化。该研究为缺血性脑卒中后以PDGFR-β或TGF-β信号为靶点改善血脑屏障功能提供了新的实验依据和治疗思路。