类型a：学术研究报告

作者及机构
本研究由Xinhua Li（宾夕法尼亚大学牙医学院基础与转化科学系、上海交通大学医学院附属第一人民医院骨科、同济大学医学院附属东方医院脊柱外科）、Shuting Yang（宾夕法尼亚大学）、Gongsheng Yuan（宾夕法尼亚大学）、Dian Jing（德州农工大学牙科学院修复科学系）、Ling Qin（宾夕法尼亚大学医学院骨科）、Hu Zhao（德州农工大学）、Shuying Yang（宾夕法尼亚大学，通讯作者）共同完成，发表于期刊《Bone Research》2022年第10卷第46期（DOI: 10.1038/s41413-022-00214-z）。

学术背景
研究聚焦于骨骼发育与血管形成的关键干细胞——II型胶原蛋白阳性（Col2+）祖细胞。尽管Col2+细胞已被确认为骨骼干细胞（SSCs），但其在胚胎期和出生后衰老过程中对骨骼发育的贡献尚不明确。骨骼发育涉及两种骨化方式：软骨内成骨（endochondral ossification，通过软骨中间体形成骨）和膜内成骨（intramembranous ossification，由神经嵴来源的间充质细胞直接成骨）。Col2α1、聚集蛋白聚糖（Acan）和Sox9是软骨细胞的标志物，其突变会导致严重的骨骼畸形。然而，Col2+细胞在骨骼发育中的具体作用机制仍需深入探索。

研究流程
1. 动物模型构建
- 通过基因编辑技术构建两种小鼠模型：
- 胚胎期Col2+细胞消融模型（Col2-cre;DTA+/−）：通过将携带白喉毒素（DTA）转基因的小鼠与Col2-cre小鼠杂交，在胚胎期特异性消融Col2+细胞。
- 出生后Col2+细胞消融模型（Col2-creERT;DTA+/+）：通过他莫昔芬（Tamoxifen）诱导出生后消融Col2+细胞。
- 使用Col2-cre;tdTomato和Col2-creERT;tdTomato小鼠进行谱系追踪，标记Col2+细胞及其后代。

1. 表型分析

   • 胚胎消融组：
     
     • 胚胎17.5天（E17.5）时，Col2-cre;DTA+/−小鼠存活，但75%的新生鼠因骨骼血管减少、椎骨完全缺失及多数骨骼（除部分颅面骨、锁骨和小片长骨/肋骨）缺失而死亡。
       
     • 组织学染色（H&E、Von Kossa）显示，胚胎消融导致脊柱、长骨和软骨的完全缺失，仅保留颅骨和少量长骨碎片，提示膜内成骨参与长骨发育但不影响脊柱发育。
       
   • 出生后消融组：
     
     • 小鼠出现生长迟缓和胶原病变表型，表现为长骨骨骺发育不良、骨量减少（Micro-CT显示骨体积分数BV/TV降低50%）。
       
     • 免疫荧光显示生长板（GP）和关节软骨中Col2+细胞减少，细胞排列紊乱。
       

2. 谱系追踪与细胞分化分析

   • 空间分布：Col2+细胞主要分布于生长板、关节软骨和骨髓，其数量和分化能力随年龄增长而下降（如1月龄小鼠GP中98.1%为Col2+细胞，而12月龄降至23.2%）。
     
   • 血管贡献：
     
     • 颅骨中几乎所有CD31+血管细胞（标记血管内皮）来源于Col2+谱系，而长骨中仅25.4%为Col2+来源；骨折修复时，长骨中95.5%的CD31+血管为Col2+谱系。
       
     • 体外实验证实，Col2+祖细胞可形成CD31+血管样结构。
       
   • 干细胞特性：
     
     • Col2+细胞具有多向分化潜能（成骨、成软骨、成脂），但不同来源的Col2+细胞分化能力差异显著（如生长板Col2+细胞的成骨能力显著高于骨髓来源细胞）。
       
     • 颅骨中的Col2−细胞仅具成骨潜能，且迁移能力更强。
       

主要结果
1. 胚胎期Col2+细胞是脊柱发育的必要祖细胞：消融导致椎骨完全缺失，证实脊柱发育完全依赖Col2+细胞驱动的软骨内成骨。
2. 膜内成骨参与长骨和肋骨发育：长骨残留的骨碎片表明Col2−细胞（可能为神经嵴来源）通过膜内成骨参与部分骨形成。
3. Col2+细胞贡献骨骼血管生成：颅骨血管完全依赖Col2+祖细胞，而长骨血管为混合来源，骨折修复时Col2+细胞主导血管再生。
4. 衰老导致Col2+祖细胞耗竭：Col2+细胞的数量和分化能力随年龄显著下降，尤其在2-3周龄时急剧减少，可能与激素调控相关。

结论与价值
1. 理论意义：首次揭示Col2+细胞通过双重机制（软骨内成骨和血管生成）调控骨骼发育，并阐明其在衰老中的动态变化。
2. 应用价值：为骨再生医学（如骨折修复、骨质疏松）提供新的靶点，Col2+或Col2−祖细胞可能成为组织工程中的优选细胞来源。
3. 临床启示：Col2+细胞减少可能与年龄相关骨关节炎和生长障碍相关，靶向维持Col2+祖细胞活性或为治疗策略。

研究亮点
1. 创新模型：首次结合胚胎/出生后双阶段消融与谱系追踪，明确Col2+细胞的时空特异性功能。
2. 跨器官发现：揭示Col2+细胞对骨骼血管的贡献，突破传统认知中血管仅来源于中胚层的观点。
3. 衰老机制：量化Col2+祖细胞的年龄依赖性耗竭规律，为衰老相关骨疾病研究提供数据支持。

其他价值
研究还发现Col2+细胞不参与破骨细胞分化（TRAP染色阴性），提示其调控骨代谢的途径集中于成骨-血管偶联。此外，颅骨与长骨血管的异质性来源为器官特异性血管生成机制提供了新视角。