类型a：单篇原创研究学术报告
一、研究概况
本研究由来自澳大利亚的Microbio Ltd.转化研究所的Lisa A. Simms和Flavia Huygens等多位研究人员合作完成。研究团队还包括Pathology Queensland、Mackay医院与健康服务中心、Spectroscopy and Data Consultants以及荷兰Qserve Consultancy B.V.等机构的成员。该研究成果于2023年7月12日在线发表于《Journal of Microbiological Methods》期刊（第211卷，论文编号106783）。
二、学术背景与研究目的
本研究属于临床微生物学与分子诊断学领域，聚焦于血流感染（bloodstream infections, BSIs）和脓毒症（sepsis）的快速诊断。脓毒症是由机体对感染的失调反应引起的危及生命的器官功能障碍，全球每年约有5000万病例，导致1100万相关死亡，约占全球总死亡人数的20%。目前，血培养（blood culture）是实验室诊断脓毒症的金标准。然而，血培养存在显著局限性：检测耗时长，需要16小时至5天（针对酵母菌）；需要大量血液样本（通常需采集2-3套，共40-60毫升），这对合并症患者、儿科患者及新生儿尤具挑战性；阳性率低，80%-89%的血培养结果为阴性；此外，对于营养和环境要求苛刻的难培养微生物（fastidious organisms），血培养的检出能力有限。有研究表明，抗生素治疗的每延迟一小时，脓毒症休克患者的死亡风险就增加9%。因此，开发一种快速、灵敏且所需血量少的诊断方法具有迫切的临床需求。基于此，本研究的目的是评估一种名为InfectID-BSI的实时定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）检测方法的临床表现，并将其与传统的血培养方法进行系统比较。
三、研究工作流详述
本研究采用前瞻性方法比较研究设计，整体流程包含伦理审批与患者招募、临床样本采集与处理、InfectID-BSI检测、阳性结果确认与争议结果裁决，以及数据分析和比较五个关键环节。
在伦理审批与患者招募环节，研究获得了皇家布里斯班妇女医院人类研究伦理委员会的批准。研究对象为2019年7月至2020年7月期间，就诊于澳大利亚昆士兰州皇家布里斯班妇女医院（929张床位）和麦凯基地医院（318张床位）急诊科的、临床评估有疑似血流感染（bloodstream infection, BSI）、脓毒症及脓毒症休克体征和症状的患者，共203名。有认知障碍或无法提供知情同意的患者被排除在外。
在样本采集与处理环节，研究共采集了375份EDTA抗凝全血样本和360份配套的血培养样本。在患者被怀疑感染并获取知情同意后，于常规血培养采血的同时，额外采集一管4毫升的EDTA全血。血培养采用BacT/Alert系统。关键步骤在于，研究人员使用Roche MagNA Pure 96仪器及配套试剂盒，从0.35毫升EDTA全血中提取DNA，用于后续的InfectID-BSI检测。
在InfectID-BSI检测环节，这是本研究的核心创新技术。InfectID-BSI是一个无需预培养、直接在全血中检测26种最普遍BSI致病菌（包括细菌和酵母菌）的qPCR试剂盒。该检测包含两个测试组，分别针对细菌和特定酵母菌。其核心技术原理是利用位于细菌和真菌基因组保守区域的高判别力单核苷酸多态性来鉴定病原体。qPCR反应使用Qiagen公司的Rotor-Gene Q实时PCR仪进行，其特殊之处在于后续的熔解曲线分析。通过比较样本与阳性对照的熔解曲线图谱和熔解温度，根据预设阈值判定每个病原体靶标的阳性或阴性结果。
在阳性结果确认与争议结果裁决环节，为解决新方法因灵敏度更高而与金标准方法结果不一致的问题，研究预设了两种裁决途径（也称“referee approach”）。第一，所有InfectID-BSI检测阳性的样本，均进行桑格双脱氧测序（Sanger bidirectional sequencing, SBDS）以确认病原体种类。第二，当血培养与InfectID-BSI结果不一致时，引入患者临床数据作为第二裁决途径。研究人员从电子病历等系统收集了心率、呼吸频率、血压、格拉斯哥昏迷评分（Glasgow coma scale）、体温、乳酸水平和近期化疗史等七项客观脓毒症风险指标，并依据昆士兰州政府成人急诊脓毒症路径指南，将患者分为脓毒症/脓毒症休克高风险、中风险和低风险。
在数据分析环节，研究采用了两种方法比较。其一，以血培养为参考方法，计算InfectID-BSI与其相比的阳性符合率（positive percent agreement, PPA）、阴性符合率（negative percent agreement, NPA）、阳性预测值（positive predictive value, PPV）和阴性预测值（negative predictive value, NPV）。其二，使用掺入已知浓度病原体的模拟样本（contrived samples）评估InfectID-BSI的性能，以弥补部分靶标在临床血培养中阳性率低的不足。研究还利用系列稀释的参比菌株生成标准曲线，对患者样本中的病原体进行定量，并将结果表示为每0.35毫升血液中的基因组拷贝数。
四、主要研究结果与分析
在方法比较的核心性能指标上，以血培养为参考，InfectID-BSI表现出极高的阴性预测值（NPV），达到99.7%。这意味着当InfectID-BSI检测结果为阴性时，排除了血流感染（BSI）的概率是99.7%，这使其成为一个极佳的“排除性”诊断工具。其阴性符合率（NPA）为99.2%。然而，阳性符合率（PPA）和阳性预测值（PPV）分别为55.6%和29.4%，这一偏低的结果需要我们结合后续裁决方法的数据来深入理解。
研究对InfectID-BSI检测阳性但血培养阴性的72个“假阳性”观察结果进行了深入分析。使用第一裁决途径——即桑格测序确认，结果显示这72个结果100%得到了确认，均为InfectID-BSI靶标上的或能够被其熔解分析检测到的相关病原体。引入第二裁决途径——即临床脓毒症风险标准，发现其中57例（79.2%）的患者具有中度或高度脓毒症风险，从临床角度强烈支持了感染的存在。这组裁决数据清晰地揭示，所谓的“假阳性”大部分是真阳性，其根本原因是作为金标准的血培养方法自身灵敏度不足。这种金标准偏倚现象在评估性能更优的新诊断方法时是已知的挑战。
此外，InfectID-BSI在研究中共检出102例病原体，而血培养仅检出54例，前者的检出灵敏度几乎是后者的两倍。这份更好的检出率直接体现在对苛养菌的检出能力上。InfectID-BSI检出了25例肺炎链球菌或绿色气球菌感染，而血培养均未检出（0例）。肺部感链球菌因营养要求苛刻且易发生自溶，在血培养中检出困难；而绿色气球菌是一种微需氧菌，与关节炎、心内膜炎、脑膜炎等疾病相关。这一结果表明，基于InfectID-BSI的数据，该队列中血流感染的病原谱将被重新定义，最常见的四种病原体依次为：大肠杆菌（28.4%）、肺炎链球菌（17.6%）以及金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌（均占13.7%）。在混合感染和对低生物负荷感染的检测上，InfectID-BSI同样展现出显著优势。
在检测速度和血量需求方面，InfectID-BSI从提取DNA到出结果耗时不到2小时，加上DNA提取约30-40分钟，总周转时间（time to result）估计小于3小时，远快于血培养的16至48小时。其检测仅需0.5毫升血液，远小于血培养所需的40-60毫升，这对新生儿和贫血的危重病人意义重大。定量数据显示了InfectID-BSI能够检测到低至每0.35毫升血液几个拷贝的病原体，并且对于同一患者不同部位采血的样本（如左右臂），其定量结果高度一致，显示了方法的稳健性。例如，对于皮肤常见污染菌表皮葡萄球菌，InfectID-BSI的定量数据就清楚地显示了其在几例患者中可能分别扮演了污染物（低拷贝数）和真正病原体（高拷贝数，如高达239个基因组拷贝）的角色。
五、研究结论与价值
本研究得出结论，InfectID-BSI的性能达到并超过了与血培养相比的验收标准。其高达99.7%的阴性预测值，确立了其作为血流感染（BSI）极具特异性的“排除性”诊断测试的地位。作为一种能够快速（小时）、微量用血（<0.5毫升）直接检测包括苛养菌在内的多种病原体并提供定量信息的分子诊断方法，InfectID-BSI作为血培养的伴随测试被采用，极有可能对导致脓毒症的血流感染的临床管理路径产生重大影响，促进更早期的精准抗生素治疗，从而改善患者预后。其全部益处还有待未来全球性的临床试验来最终确定。
六、研究亮点
本研究有以下突出亮点：第一，发现了传统血培养方法因灵敏度限制而对病原谱认知存在严重偏差，并基于InfectID-BSI的数据重新绘制了该研究队列中的血流感染病原体流行图谱，将肺炎链球菌和绿色气球菌提升至重要位置。第二，该检测方法仅需极微量的血液样本（0.5毫升），并能实现快速定量检测（小时），结合其极高的阴性预测值，展现了作为“排除性”诊断工具的巨大临床转化潜力。第三，研究设计科学地采用了桑格测序确认和临床脓毒症风险评分两种“裁决途径”来解决因“金标准”方法不完美所致的评估偏倚，其方法论对于同类诊断技术的评估具有很好的参考价值。