本研究发表于《Circulation Research》期刊2023年3月3日出版的132卷（545–564页）。主要通讯作者为斯坦福大学医学院的Marlene Rabinovitch教授。研究团队来自斯坦福大学医学院、贝蒂·艾琳·摩尔儿童心脏中心、Vera Moulton Wall肺动脉血管疾病中心、斯坦福心血管研究所以及儿科（心脏病学）、遗传学、医学等系科。

学术背景

本研究聚焦于肺动脉高压（PAH）的病理机制领域。肺动脉高压是一种进行性且致命的疾病，即使采用现有血管舒张疗法，在缺乏肺移植的情况下仍可致死。其特征包括内皮细胞凋亡、内皮-间质转化、炎症、弹性纤维降解等，最终导致肺小动脉闭塞和丧失，肺血管阻力严重升高，进而引发右心衰竭。已知骨形态发生蛋白受体2（Bone Morphogenetic Protein Receptor 2, BMPR2）基因突变与家族性和散发性PAH密切相关，约70%的家族性PAH和20%的特发性PAH患者存在BMPR2突变（统称为遗传性PAH）。此外，即使在没有明确突变的特发性PAH或其他相关疾病导致的PAH患者中，BMPR2的表达也常常降低。以往的大量研究主要集中在BMPR2缺失对肺动脉内皮细胞（PAEC）功能障碍的影响上，而BMPR2在肺动脉平滑肌细胞（PASMC）中的功能缺失与PAH发病之间的功能和分子联系，尽管已有一些证据表明其可能通过细胞自主性方式促进病变形成，但仍需进一步深入探究。

因此，本研究旨在阐明BMPR2在PASMC中的缺失，如何具体导致这些细胞出现异常表型，从而参与PAH的发病过程。研究目标包括：确定PASMC中BMPR2减少是否以及如何与PAH中PASMC的异常表型相关；揭示其背后的分子机制；并探索潜在的治疗干预靶点。

详细研究流程

本研究采用了一套严谨的多层次、多模型的研究策略，结合转基因小鼠模型、人原代细胞培养以及分子生物学技术，系统性地探究了平滑肌细胞特异性BMPR2缺失在PAH中的作用及机制。主要流程如下：

1. 构建和分析转基因小鼠模型：

   • 研究对象与样本量：研究构建了两种主要的转基因小鼠模型。第一种是平滑肌细胞特异性敲除小鼠（BKOsmc），通过将Bmpr2-floxed小鼠与表达平滑肌特异性启动子（Tagln-cre）的小鼠杂交获得，同时携带Rosa26报告基因以追踪敲除效率。由于部分BKOsmc小鼠因严重心脏畸形在出生后死亡，研究分析了存活至8周龄的雄性小鼠（n=5-8只/组），并检查了胚胎期（E19.5）的心脏缺陷。第二种是诱导性平滑肌细胞特异性敲除小鼠（iBKOsmc），使用Acta2-creER系统，使Bmpr2的敲除可在成年期通过他莫昔芬饮食诱导，避免了发育期致死性问题，同时引入了tdTomato报告基因。此外，还构建了在iBKOsmc基础上进一步杂合敲除一个Arrb2等位基因的小鼠（iBKO-iAhetsmc），用于验证Arrb2的作用。
   • 实验处理与分析：
     • 表型分析：将8周龄的BKOsmc、iBKOsmc、iBKO-iAhetsmc及相应的野生型或诱导型对照小鼠（WT或iWT）分别置于三种条件下：常氧环境（室内空气）、慢性低氧环境（10% O2，3周）、以及慢性低氧后恢复常氧环境（4周）。
     • 生理学评估：对小鼠进行超声心动图检查，测量肺动脉加速时间（PAAT）等参数以评估肺动脉压力；通过右心导管直接测量右心室收缩压（RVSP）；处死小鼠后，计算右心室与左心室加室间隔的重量比（RV/(LV+S)），作为右心室肥厚的指标。
     • 组织学与形态计量学：取肺组织进行切片和染色（如苏木精-伊红染色、免疫荧光染色）。对远端肺动脉（肺泡壁和肺泡管水平）的肌化程度进行定量分析，计算肌化动脉占总动脉数的比例，并统计每100个肺泡对应的动脉数量，以评估肺血管重塑情况。所有分析均在研究者对分组信息不知情的情况下进行。
     • 分子验证：通过PCR基因型鉴定、报告基因（LacZ或tdTomato）染色以及实时定量PCR（RT-qPCR），确认BMPR2在目标细胞（平滑肌细胞）中的特异性敲除效率，并检查其他组织（如内皮细胞、心脏、肺整体）中的敲除情况。

2. 细胞水平的功能与机制研究：

   • 研究对象：
     • 小鼠原代PASMC：从BKOsmc和WT对照小鼠的大型肺动脉中分离获得。
     • 人原代PASMC：来源分为两组。第一组来自无已知PAH的未使用供体肺（作为对照），通过小干扰RNA（siRNA）敲低BMPR2表达（siBMPR2）以模拟功能缺失。第二组来自携带BMPR2突变（PAH-BMPR2mut）并接受肺移植的PAH患者的肺组织。所有人原代细胞均来自肺动脉高压突破计划（PHBI）。
   • 样本量：体外实验通常以独立供体或小鼠作为生物学重复，样本量n通常为3或4（如免疫印迹、部分功能实验），部分实验（如细胞计数、MTT）n=4。论文中具体说明了每个实验的重复次数。
   • 实验方法与分析：
     • 细胞表型分析：
       • 增殖能力：采用MTT法或直接细胞计数法评估细胞增殖。
       • 存活/抗凋亡能力：在血清剥夺条件下，通过Caspase-Glo 3/7活性检测试剂盒评估细胞凋亡情况，或通过细胞计数评估存活率。
       • 收缩功能：使用胶原凝胶收缩实验。将PASMC嵌入胶原凝胶中，给予血管紧张素II（Ang II）或骨形态发生蛋白4（BMP4）刺激，测量凝胶收缩后的残余面积，评估细胞收缩能力。
     • 分子机制探索：
       • 信号通路蛋白检测：使用蛋白质免疫印迹（Western Blot）技术，检测关键信号分子的蛋白水平及其磷酸化状态，包括：pERK1/2, pp38, pSMAD2/3, ARRB2, pAKT(Ser473), pGSK3β(Ser9), 总β-catenin及活性β-catenin（ABC）, 总RhoA/Rac1及活性RhoA/Rac1（使用活性蛋白下拉检测试剂盒），以及平滑肌收缩相关蛋白（如α-SMA, SM22α, Calponin）。
       • 基因表达调控：使用siRNA分别或联合敲低BMPR2、ARRB2、CTNNB1（β-catenin基因）、SMAD2/3等基因，观察对上述信号通路和细胞表型（增殖、收缩）的影响，以确定上下游关系。
       • 抑制剂干预：使用药理抑制剂（如p38抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂PD98059、AKT抑制剂GSK690693）处理细胞，进一步验证特定激酶在信号传导中的作用。
       • 免疫荧光与共聚焦显微镜：
         • 分析人/鼠肺组织切片中ARRB2、活性β-catenin与平滑肌标志物（如α-SMA）的共定位及亚细胞分布（细胞质/核）。
         • 在培养的PASMC中，用鬼笔环肽标记丝状肌动蛋白（F-actin），观察细胞骨架结构，并定量分析平均每个细胞的F-actin含量。
         • 检测组织中pAKT(Ser473)和增殖标志物Ki67的表达。
       • 肌动蛋白聚合状态分析：使用G/F-actin体内检测试剂盒，分析丝状肌动蛋白与球状肌动蛋白的比例（F/G-actin ratio）。

3. 数据分析工作流程： 所有数据均使用GraphPad Prism软件进行统计分析。对于样本量n≥6的数据，先进行Shapiro-Wilk正态性检验。所有通过检验的数据，根据组别数量采用参数检验：两组比较使用未配对双尾t检验（Welch校正）；多于两组使用单因素ANOVA；多条件多组比较使用双因素ANOVA，并采用Tukey事后检验进行多重比较校正。对于样本量n的数据（因无法可靠检验正态性），采用非参数检验：两组比较使用Kolmogorov-Smirnov检验；多于两组使用Kruskal-Wallis检验，并采用Dunn事后检验进行校正。P值<0.05被认为具有统计学显著性。对于n=3的比较，文中标注了非参数检验能达到的最小P值（0.1000）。

主要研究结果

1. 平滑肌细胞BMPR2缺失导致小鼠对低氧的血管反应性降低及慢性低氧后肺动脉高压持续存在：

   • BKOsmc小鼠在急性低氧刺激下，肺动脉收缩反应减弱（RVSP升高幅度小于WT）。
   • 经过3周慢性低氧后，BKOsmc小鼠的肺动脉高压程度（RVSP、RV/(LV+S)）实际上略低于WT小鼠，这可能与血管收缩反应减弱有关。
   • 然而，在低氧后恢复常氧4周，WT小鼠的肺动脉高压指标基本恢复正常，而BKOsmc小鼠的RVSP、右心室肥厚以及远端肺动脉的肌化程度均持续处于高水平，未能消退。这表明平滑肌细胞BMPR2缺失导致了肺血管重塑的“不可逆性”或持续性。

2. BMPR2缺失的PASMC表现出“高增殖、低收缩”的异常表型：

   • 从BKOsmc小鼠分离的PASMC，在体外表现出增殖加快、抗血清剥夺诱导的凋亡能力增强（存活率升高）。
   • 同时，这些细胞的收缩功能受损，无论是在基础状态下还是在对Ang II或BMP4的反应中，其胶原凝胶收缩能力均显著低于WT来源的PASMC。
   • 在人原代PASMC中，通过siRNA敲低BMPR2（siBMPR2）或使用来自PAH-BMPR2mut患者的PASMC，均重复出了相同的“高增殖、低收缩”表型。

3. 分子机制解析：ARRB2是连接BMPR2缺失与异常表型的核心枢纽：

   • 上游激活通路：BMPR2缺失的PASMC中，磷酸化的ERK1/2（pERK1/2）、p38（pp38）以及SMAD2/3（pSMAD2/3）水平升高。使用抑制剂或siRNA实验证明，pERK1/2激活p38，进而增加pSMAD2/3，最终导致支架蛋白β-arrestin 2（ARRB2）的表达上调。
   • 驱动高增殖的机制：升高的ARRB2促进了蛋白激酶B的磷酸化（pAKT），活化的pAKT使糖原合酶激酶3β（GSK3β）在Ser9位点磷酸化而失活。GSK3β的失活阻止了其对β-catenin的降解，导致活性β-catenin（ABC）在细胞核内积聚。核β-catenin作为转录共激活因子，促进增殖相关基因的表达，从而驱动细胞过度增殖和抗凋亡。在BMPR2缺失的人或鼠PASMC以及PAH患者突变PASMC中，均观察到了ARRB2-pAKT-ABC轴的激活。敲低ARRB2或CTNNB1可逆转高增殖表型。
   • 导致低收缩的机制：升高的ARRB2同时导致了小G蛋白RhoA和Rac1（总蛋白及活性形式）的表达降低。RhoA/Rac1是调节细胞骨架和收缩功能的关键分子。与此一致，BMPR2缺失的PASMC中，平滑肌特异性收缩蛋白之一SM22α的表达下降，肌动蛋白应力纤维（F-actin）减少，丝状/球状肌动蛋白比例降低，细胞骨架结构受损。这些变化共同导致了细胞收缩能力下降。敲低ARRB2能够恢复RhoA/Rac1水平，并改善细胞收缩功能。
   • 动物模型验证：在诱导性平滑肌细胞BMPR2敲除小鼠（iBKOsmc）中，观察到了与BKOsmc相似的持续性肺动脉高压表型。然而，在同时杂合敲除一个Arrb2等位基因的iBKO-iAhetsmc小鼠中，慢性低氧后恢复期的肺动脉高压、右心室肥厚及血管肌化均被显著阻止，其表型与对照小鼠无异。从这些小鼠肺血管中分离的蛋白也显示，ARRB2水平正常化，同时ABC和RhoA的表达也得以恢复。

研究结论

本研究系统性地证明了肺动脉平滑肌细胞（PASMC）中BMPR2的功能缺失，通过激活pERK1/2-p38-pSMAD2/3信号轴，导致支架蛋白ARRB2上调，进而引发两条平行的下游效应：一方面，ARRB2通过增强pAKT信号，使GSK3β失活，稳定并促进β-catenin入核，驱动细胞异常增殖和抗凋亡；另一方面，ARRB2的上调抑制了RhoA/Rac1信号通路，破坏了平滑肌细胞的收缩装置和骨架结构，导致收缩功能受损。这种“高增殖、低收缩”的细胞表型，在动物模型中表现为慢性低氧刺激后肺动脉高压的持续存在和血管重塑的不消退。因此，PASMC中失调的BMPR2-ARRB2轴是PAH发生发展的重要机制。

研究指出，针对由BMPR2缺失引起的ARRB2升高进行干预，有可能预防或逆转PAH中PASMC的异常表型，从而为治疗PAH提供了新的潜在靶点。

研究的亮点与价值

1. 重要的科学发现：明确揭示了平滑肌细胞自主性的BMPR2缺失在PAH发病中的独立作用及其详细的分子机制，将ARRB2确立为连接BMPR2缺失与PASMC异常表型的核心分子节点。
2. 研究模型的创新性：成功构建并利用了两种平滑肌细胞特异性BMPR2敲除小鼠模型（包括克服发育致死性的诱导型模型），并创建了在此基础上干预ARRB2的复合基因模型，为在体验证机制提供了有力工具。
3. 临床相关性高：研究不仅使用了基因工程小鼠和 siRNA 干预的细胞模型，还直接采用了来自携带BMPR2突变的PAH患者的原代PASMC进行验证，使研究发现具有直接的疾病相关性。
4. 机制阐释的全面性与清晰性：研究从整体动物表型到细胞功能，再到分子信号通路，层层递进，逻辑严密。不仅发现了表型，更完整地描绘了从BMPR2缺失到ERK/p38/SMAD，再到ARRB2，并分叉至β-catenin（增殖）和RhoA/Rac1（收缩）的完整信号网络。
5. 转化医学潜力：研究结论直接提示ARRB2是一个潜在的治疗靶点。在动物模型中，即使仅部分降低ARRB2（杂合敲除）也能有效预防疾病表型，这为开发靶向ARRB2或其下游通路的药物提供了重要的临床前依据。

其他有价值的内容

研究还提及，虽然BMPR2在正常PASMC中的表达水平低于内皮细胞，但大量证据表明PAH中PASMC的高增殖表型与其细胞自主性的BMPR2减少有关。此外，研究团队此前的工作显示，内皮细胞中BMPR2缺失也会导致肺动脉高压持续存在，本研究则补充了平滑肌细胞方面的机制，强调了在考虑增强BMPR2信号的策略时，需要同时关注内皮细胞和平滑肌细胞两方面的作用。文章附带的图表摘要直观地概括了整个信号通路和表型关联，有助于读者快速理解研究的核心内容。