骨靶向AAV介导的Schnurri-3沉默防止骨质疏松中的骨丢失研究报告

2019年，Yeon-Suk Yang, Jun Xie, Dan Wang等学者在《Nature Communications》发表了一篇题为《Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis》的研究论文（https://doi.org/10.1038/s41467-019-10809-6）。该研究由美国马萨诸塞大学医学院的多部门合作完成，包括医学/风湿病学科（Rheumatology）、Horae基因治疗中心、微生物与生理系统学科、Li Weibo罕见病研究所，以及病毒载体核心实验室等。

背景与研究目标

骨质疏松是一种常见的骨代谢疾病，其主要特征在于骨形成和骨吸收之间的平衡紊乱，导致骨密度降低和骨结构破坏，进而增加骨折的风险。现有治疗骨质疏松症的药物主要通过抑制破骨细胞减少骨吸收，但这些药物往往伴随着严重的副作用（如非典型股骨骨折和颌骨坏死），且仅有少量昂贵的药物可促进成骨细胞功能。此外，用于增加骨质量的新型药物（如抗Sclerostin抗体和Cathepsin K小分子抑制剂）在临床试验中显示出心血管副作用。

鉴于此，该研究团队把Schnurri-3（Shn3）这一适配蛋白作为治疗靶点。Shn3被认定为骨形成的强效内源性抑制因子，其通过降解Runx2蛋白和抑制Wnt信号通路来调控成骨细胞分化。小鼠研究表明，Shn3的删除可显著增加骨质量，且对非骨骼组织无不良影响。因此，研究旨在探讨通过AAV9（腺相关病毒9型）载体在体内对Shn3进行靶向RNA干扰（RNAi）疗法的可能性，并开发一种新型骨靶向基因治疗工具。

研究流程与方法

1. AAV9的骨细胞转导效率筛选

通过构建一个表达绿色荧光蛋白（EGFP）的自互补AAV（scaav）载体并将其包装到14种不同的AAV衣壳中，研究团队首先筛选了能够有效转导骨和软骨细胞系的AAV血清型。这些血清型包括AAV1至AAV9，以及若干突变型（如AAVrh.10）。实验分别在成骨细胞（cOBs）、骨髓来源的破骨前体细胞（BM-OCPs）和软骨细胞（ATDC5s）中进行，结果表明AAV9是最有效的能够转导cOBs的血清型。

为了评估不同血清型在体内的表现，他们将选定的AAV血清型载体注射到2月龄小鼠的膝关节腔，并检测EGFP表达。最终发现，AAV9在骨组织（如股骨小梁骨和皮质骨）的成骨细胞及破骨细胞中表现出显著的EGFP表达。

2. 系统性递送AAV9载体验证

为了进一步确认AAV9对骨组织的靶向性，研究团队通过尾静脉注射AAV9-EGFP到2月龄小鼠体内，2周后对EGFP在全身各组织中的表达分布进行检测。他们发现，AAV9可以很好地转导内侧骨端骨组织中的成骨细胞和骨细胞，而对非骨组织（如肝脏、心脏和脾脏）的转导能力较低。

3. 诱导性Shn3基因敲除对骨形成的影响

团队利用一组小鼠模型，通过在成骨细胞中条件性敲除Shn3来评估短期抑制该基因对骨骼的影响。他们发现，Shn3的缺失显著增加了股骨头小梁骨质量，并促进了成骨。

4. 靶向Shn3的RNAi治疗

研究团队设计了一种人工微小RNA（artificial microRNA，amir）来特异性靶向并沉默Shn3基因。他们将amir插入AAV9载体中，并通过膝关节局部注射和尾静脉注射进行验证。结果显示，在局部注射中，AAV9-amir-Shn3成功减少了Shn3的mRNA表达量，并显著增加了骨质量。

进一步的实验探索了系统性递送AAV9-amir-Shn3对骨质疏松小鼠的治疗效果。结果显示，Amir-Shn3通过促进成骨细胞的活性完全逆转了卵巢切除（OVX）小鼠模型的骨丢失，同时改善了骨骼的机械性能（如弯曲刚度、强度等）。

5. 新型骨靶向衣壳的开发

团队通过将骨靶向肽序列((AspSerSer)6，DSS)插入AAV9衣壳蛋白的两种结构位置（VP2的N端或Q588位置）来研发新型骨靶向载体，命名为AAV9.DSS-Nter。体内试验表明，该新型载体成功实现了减少对非骨组织的转导（如肝脏和肌肉），同时保留了对骨组织的高转导效率。

最终结果表明，AAV9.DSS-Nter载体能够高效表达Amir-Shn3，从而在OVX骨质疏松模型中显著提高股骨小梁骨密度，同时避免对非靶组织可能造成的潜在风险。

研究主要结果

1. Shn3基因是治疗骨质疏松的有效靶点： 无论是条件性敲除还是RNAi沉默均显著促进骨形成。
2. AAV9是一种有效的载体： 系统性递送AAV9可有效靶向骨组织中的成骨细胞和破骨细胞。
3. 骨靶向AAV9.DSS-Nter的成功研发： 显著减少了非靶器官（如心脏、肝脏等）的基因转导，从而提高治疗的专一性和安全性。
4. 治疗数据： AAV9-amir-Shn3的递送在卵巢切除模型中完全逆转了骨质疏松，显示出极高的临床应用潜力。

研究结论与价值

该研究表明，Schnurri-3的沉默能够通过增加成骨生物活性实现有效的骨质疏松干预。与需要频繁重复注射的非病毒基因疗法（如脂质体和纳米粒子）不同，单次递送的AAV载体具有长效持续作用，并且通过优化的DSS-Nter衣壳进一步提升了骨靶向性和安全性。研究不仅为骨质疏松的治疗开辟了新途径，还提供了对未来基因治疗技术的优化方向。

研究亮点

1. 创新性： 首次证明AAV9载体能够系统性转导成年小鼠骨中成骨细胞。
2. 治疗潜力： AAV9-amir-Shn3可用作强效骨生成制剂，支撑其向临床转化。
3. 安全性改进： 新开发的AAV9.DSS-Nter显著提高了骨专一性，减少潜在副作用。
4. 全新骨靶向策略： 骨靶向序列（DSS）的应用，增强了载体对治疗相关细胞的高效递送。

展望

尽管该研究展现了AAV9和改良型骨靶向载体在骨代谢疾病治疗中的潜力，但进一步的长期安全性及有效性研究需要完成。此外，这种基因疗法技术也可能在其他骨相关疾病（如骨折修复）中显示应用价值，为未来的精准骨科治疗提供了有力支持。