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基于磷酸钙纳米制剂选择性消除癫痫神经元苯妥英耐药性以终止癫痫发作的研究报告

一、 研究作者、单位与发表信息

本研究由Qiwen Guan, Xuan Wang, Danfeng Cao, Menghuan Li, Zhong Luo* 和 Xiaoyuan Mao* 合作完成。通讯作者分别为中南大学湘雅医院的毛小元（Xiaoyuan Mao）和重庆大学的罗忠（Zhong Luo）。参与单位包括中南大学湘雅医院（临床药理研究所、国家老年病临床研究中心）、中南大学临床药理研究所（药物基因组应用技术教育部工程研究中心）、重庆大学生命科学学院以及长沙医学院院士工作站和湖南省高校功能核酸基础与临床研究重点实验室。

该研究成果以研究论文（Research Article）的形式，于2023年发表在学术期刊 《Small》 上，文章识别号为 DOI: 10.1002/smll.202300395，文章标题为《Calcium phosphate-based nanoformulation selectively abolishes phenytoin resistance in epileptic neurons for ceasing seizures》。

二、 学术背景与研究目的

本研究的科学领域聚焦于纳米医学、神经药理学和癫痫治疗学的交叉领域。癫痫是一种全球范围内影响约1%人口的常见脑部疾病，其特征是神经元异常同步放电。苯妥英（Phenytoin， PHT）是临床上用于治疗急性和慢性癫痫发作的一线抗癫痫药物（AEDs），其作用机制是通过阻断电压门控钠通道来降低神经元的生物电活性。

然而，PHT的临床应用面临两大关键挑战，这直接导致了本研究的目的：1. 血脑屏障（Blood-Brain-Barrier， BBB）穿越能力差：BBB严重限制了PHT从血液向癫痫神经元的转运，通常需要大剂量给药以确保足够的脑内积累，这又会引起不可忽视的副作用，如牙龈增生、多毛症以及严重的皮肤不良反应（如史蒂文斯-约翰逊综合征）。2. 获得性耐药：在癫痫神经元中，由基因ABCB1编码的药物外排泵P-糖蛋白（P-glycoprotein， P-gp）通常会过表达，导致内化的PHT分子被快速泵出细胞，从而削弱其治疗效力。这种P-gp介导的药物外排是一个消耗三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate， ATP）的过程。

此外，近年研究表明，癫痫神经元中的缺氧微环境是一个关键特征，它通过激活缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α， HIF1α）-ABCB1信号轴来上调P-gp的表达。同时，作为神经元中主要的耗氧过程，线粒体氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation， OXPHOS）是ATP生成的主要途径。

基于以上背景，本研究旨在开发一种新型的纳米集成策略，以同时解决BBB递送和PHT耐药性问题。具体目标包括：构建一种能够高效穿越BBB并靶向癫痫神经元的PHT纳米递送系统；利用该纳米系统在神经元内释放的成分（特别是钙离子，Ca2+），通过抑制OXPHOS来逆转细胞缺氧并阻断ATP生成，从而同时抑制P-gp的表达和功能，最终增强PHT在神经元内的滞留和治疗效果，为临床治疗耐药性癫痫提供新途径。

三、 详细研究流程与方法

本研究包含一个系统性的工作流程，从纳米制剂的合成表征、体外细胞实验，到体内动物模型验证，层层递进。

第一流程：纳米制剂CAP@PHT-PEG-TAT的合成与表征 * 研究材料：以磷酸钙（Calcium phosphate， CAP）为无机载体材料，苯妥英（PHT）为模型药物，聚乙二醇化（PEGylated）的TAT肽（一种细胞穿膜肽）为靶向修饰分子。 * 方法细节： 1. 合成：首先通过生物矿化法将PHT掺入CAP纳米颗粒核心，形成CAP@PHT。随后，通过铜催化的点击化学反应，将预先合成的PO4-PEG1000-TAT连接到CAP@PHT表面，得到最终纳米制剂CAP@PHT-PEG-TAT。作为对照，也合成了未载药的CAP@PEG-TAT。 2. 表征： * 形貌与尺寸：使用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察纳米颗粒呈均匀球形，动态光散射（DLS）显示平均尺寸约为90纳米，负载PHT不影响其形貌和尺寸。 * 表面电荷与组成：Zeta电位分析显示，CAP表面带负电（约-15 mV），修饰PEG-TAT后变为接近中性（约-1 mV），证实了TAT的成功连接。X射线衍射（XRD）和选区电子衍射（SAED）分析表明纳米颗粒处于非晶态，有利于在溶酶体酸性环境中降解。能量色散X射线光谱（EDS）元素映射确认了钙、磷、碳元素的存在。 * 药物释放：在模拟生理环境（pH 7.4）和溶酶体酸性环境（pH 5.5）中进行体外药物释放实验。高效液相色谱（HPLC）分析显示，在pH 7.4时PHT释放可忽略不计，而在pH 5.5时，24小时内累积释放率达到80%，证明了其酸触发释放特性。

第二流程：体外细胞水平评估纳米制剂的摄取、BBB穿透能力及生物安全性 * 研究对象与样本量：使用了两种小鼠神经元细胞系HT22和Neuro2a进行实验。每组实验设置了对照组、CAP@PHT组和CAP@PHT-PEG-TAT组。 * 方法细节： 1. 细胞摄取：使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记纳米颗粒，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞术定量分析神经元对纳米颗粒的摄取。结果显示，与CAP@PHT相比，CAP@PHT-PEG-TAT在HT22和Neuro2a细胞中的摄取分别增加了7倍和4.5倍。 2. BBB穿透能力模拟：建立了基于Matrigel的3D神经元球体模型来模拟BBB。CLSM成像显示，CAP@PHT-PEG-TAT组的荧光信号均匀分布于整个神经元球体，而CAP@PHT组的荧光仅停留在球体最外层，证明了PEG-TAT修饰能显著增强纳米颗粒的BBB穿透能力。 3. 生物安全性评估：通过细胞形态观察、MTT法检测细胞活力以及流式细胞术检测细胞凋亡，证实CAP@PHT-PEG-TAT纳米制剂在实验浓度下对神经元无明显毒性作用。

第三流程：体内评估纳米制剂的脑靶向性、生物分布及生物安全性 * 研究对象与样本量：使用Balb/c裸鼠和C57BL/6J小鼠。生物分布实验每组n=6；生物安全性评估涉及多个指标检测。 * 方法细节： 1. 生物分布与脑靶向：通过尾静脉注射Cy5.5标记的纳米颗粒（CAP@PHT-Cy5.5 或 CAP@PHT-PEG-TAT-Cy5.5），利用活体成像观察其在主要器官（心、肝、脾、肺、肾、脑）的分布。结果显示，CAP@PHT-PEG-TAT-Cy5.5主要积聚于大脑，而其他器官的荧光信号显著低于CAP@PHT-Cy5.5组，证明其高效的脑靶向能力。 2. BBB完整性评估：使用伊文思蓝（Evans Blue， EB）渗出实验评估纳米制剂对BBB完整性的影响。结果显示，与阳性对照甘露醇（可破坏BBB）不同，CAP@PHT-PEG-TAT穿越BBB时未影响其结构和功能完整性。 3. 体内生物安全性：通过苏木精-伊红（H&E）染色检查主要器官的病理学变化，并检测血液生化指标（ALT、AST、尿素、肌酐、总蛋白）和血常规。所有结果均显示纳米制剂处理组与空白对照组无显著差异，表明其具有良好的体内生物相容性。

第四流程：在急性癫痫小鼠模型中评估抗癫痫疗效 * 研究对象与样本量：使用C57BL/6J小鼠，通过腹腔注射戊四氮（Pentylenetetrazole， PTZ， 70 mg/kg）建立急性癫痫模型。每组n=6（行为学）或n=4（脑电图）。 * 方法细节： 1. 行为学评分：在PTZ注射后30分钟内，根据改良的Racine量表对小鼠的癫痫发作进行评分，记录发作次数、持续时间、潜伏期和死亡率。 2. 脑电图（EEG）记录：通过植入海马CA3区的电极，在治疗后连续3天（每天2小时）记录EEG信号。分析指标包括总功率（Total power）、基线功率（Baseline power）和癫痫样放电（Spikes）频率。 3. 神经病理学检查：通过尼氏（Nissl）染色评估海马CA1区神经元损伤，通过免疫荧光检测神经元标志物NeuN、星形胶质细胞标志物GFAP和小胶质细胞标志物Iba1的表达变化。 * 结果概要：与对照组相比，CAP@PHT-PEG-TAT处理显著降低了PTZ诱导小鼠的全身性发作（GS）频率和持续时间、发作评分、EEG总功率和癫痫样放电，并提高了神经元存活率，减少了神经胶质细胞的异常激活（胶质增生），同时所有小鼠均存活。

第五流程：在耐药性癫痫小鼠模型中评估逆转耐药的效果 * 研究对象与样本量：使用C57BL/6J小鼠，先通过腹腔注射毛果芸香碱（Pilocarpine， Pilo）诱导癫痫，然后连续14天腹腔注射PHT（20 mg/kg）以建立PHT耐药模型。每组n=13（行为学）或n=5（EEG）。 * 方法细节：建模成功后，给予单次尾静脉注射治疗（PBS、游离PHT或CAP@PHT-PEG-TAT），1小时后再给予Pilo激发，随后进行为期90分钟的行为学评分和连续3天的EEG监测。 * 结果概要：CAP@PHT-PEG-TAT处理显著降低了耐药癫痫小鼠的发作评分、GS倾向、发作次数和持续时间，延长了发作潜伏期，并降低了EEG总功率和癫痫样放电。这表明该纳米制剂能够有效逆转由Pilo诱导的癫痫模型中的PHT耐药性。

第六流程：分子机制探究 * 研究对象与样本量：取自上述Pilo诱导的耐药癫痫模型小鼠的海马组织样本，每组n=4或n=6。 * 方法细节与结果： 1. 基因和蛋白表达：通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）检测。结果显示，CAP@PHT-PEG-TAT处理显著降低了海马组织中HIF1α和ABCB1的mRNA水平，以及HIF1α和P-gp的蛋白表达水平。免疫荧光染色进一步证实海马CA1区HIF1α蛋白丰度下降。 2. 能量代谢与钙离子水平：检测海马组织中ATP和Ca2+浓度。结果显示，CAP@PHT-PEG-TAT处理显著降低了ATP水平，同时提高了Ca2+浓度。 3. 神经元活性标志物：免疫荧光显示c-Fos蛋白（神经元活性标志物）分布减少。

数据分析流程：所有数据均使用GraphPad Prism 9.0软件进行分析。首先用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。正态分布数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA）或重复测量双因素方差分析（RM-two-way ANOVA），随后进行Tukey‘s、Sidak’s检验或非配对t检验。非正态数据采用Kruskal-Wallis检验。结果以均值±标准误表示，*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001被认为具有统计学显著性。

四、 主要研究结果及其逻辑关联

本研究的结果环环相扣，逻辑链条清晰：

1. 成功构建了多功能纳米递送系统：合成与表征结果（流程一）证实了CAP@PHT-PEG-TAT的成功制备。其均匀的纳米尺寸、酸触发释放特性以及TAT肽修饰带来的表面电荷变化，为后续的细胞摄取和BBB穿透奠定了基础。
2. 验证了纳米系统的靶向递送效率与安全性：体外细胞实验（流程二）证明，PEG-TAT修饰极大地促进了神经元对纳米颗粒的摄取和3D神经球体的穿透。体内实验（流程三）则直观显示，该纳米制剂能选择性地在脑内富集，且不破坏BBB完整性，对主要器官和血液指标无不良影响。这些结果为后续的药效评价提供了前提，确保了观察到的疗效来自于纳米制剂的有效递送而非全身毒性。
3. 证明了纳米系统在急性和耐药癫痫模型中的卓越疗效：在PTZ急性模型（流程四）和Pilo耐药模型（流程五）中，CAP@PHT-PEG-TAT均表现出比游离PHT或未靶向纳米颗粒更强的抗癫痫活性。这不仅仅是简单的药物递送效果，因为在耐药模型中，游离PHT已失效，而纳米制剂依然有效，强烈提示其具有逆转耐药的独特机制。
4. 阐明了逆转耐药的双重分子机制：机制研究（流程六）将药效与分子变化直接关联。结果揭示：纳米颗粒在神经元溶酶体酸性环境中降解释放的Ca2+离子是关键效应分子。Ca2+通过抑制线粒体OXPHOS，产生两个协同作用：① 减少氧消耗，逆转神经元缺氧状态，从而下调HIF1α及其下游靶点ABCB1/P-gp的表达；② 直接减少ATP生成，而ATP是P-gp泵功能的能量来源，从而抑制了残留P-gp的外排功能。这一“表达抑制+功能失活”的双重打击，最终显著提高了PHT在癫痫神经元内的滞留（流程图中的“PHT retention”），从而克服了耐药性。海马组织中ATP下降和Ca2+升高的检测数据直接支持了这一机制。

五、 研究结论与价值意义

本研究得出结论：成功开发了一种基于生物相容性、可降解的非晶态磷酸钙（ACP）的纳米集成PHT递送系统（CAP@PHT-PEG-TAT）。该系统能高效穿越BBB并靶向癫痫神经元，在溶酶体内降解释放的Ca2+离子通过抑制OXPHOS，同时逆转缺氧以抑制P-gp表达，并切断ATP供应以失活P-gp功能，从而双管齐下地废除了PHT耐药性，显著增强了PHT的抗癫痫疗效，且在临床相关条件下表现出良好的安全性。

科学价值： 1. 提出了癫痫耐药性治疗的新范式：将纳米药物递送与细胞代谢调控（通过Ca2+调节OXPHOS）相结合，超越了传统的单纯“增加药物剂量”或“抑制单个靶点”的策略。 2. 深入揭示了Ca2+在抗癫痫中的新角色：将Ca2+从通常认为的“神经兴奋性调节因子”角色，拓展为“代谢调节器和耐药逆转剂”，为理解钙信号在神经系统疾病中的作用提供了新视角。 3. 验证了“缺氧-HIF1α-P-gp”轴作为耐药关键靶点的有效性，并为干预该通路提供了具体的纳米工具。

应用价值： 1. 为临床耐药性癫痫的治疗提供了极具前景的新策略。该纳米平台有望降低PHT的临床使用剂量，从而减少其严重的副作用。 2. 所开发的CAP纳米平台具有通用性。其良好的生物相容性、易修饰性和生物降解性，以及“载体本身即具有治疗功能（Ca2+释放）”的特性，使其有望成为递送其他中枢神经系统药物、克服其他类型脑部疾病耐药性的通用平台。

六、 研究亮点

1. “一石三鸟”的巧妙设计：单个纳米制剂同时解决了BBB递送、抑制P-gp表达和耗尽P-gp功能能量这三个关键难题，设计精巧，逻辑严密。
2. 载体与药物的协同治疗：磷酸钙纳米载体不仅是惰性的输送工具，其降解产物Ca2+本身就是发挥治疗作用（逆转耐药）的核心活性成分，实现了载体与药物的完美协同。
3. 机制研究的深度与完整性：研究从动物行为、电生理到分子基因蛋白水平，完整地揭示了纳米制剂从递送到起效的全链条机制，证据充实，说服力强。
4. 模型系统的全面性：研究涵盖了急性发作（PTZ）和慢性耐药（Pilo+PHT）两种不同特征的癫痫小鼠模型，全面评估了纳米制剂的即刻抗惊厥效果和长期逆转耐药潜力，更具临床参考价值。
5. 对安全性的充分重视：从体外细胞毒性到体内器官病理、血液生化，进行了系统的生物安全性评估，为其潜在的临床转化提供了重要的安全性数据支持。

七、 其他有价值内容

文中还提及，与以往报道的病毒蛋白笼状PHT递送系统相比，本研究采用的ACP纳米颗粒具有更好的生物相容性、更灵活的化学修饰性以及作为生物矿物的内在安全性优势。此外，作者也客观指出了研究的局限性，例如ACP纳米颗粒是否会影响跨神经元膜的其他药物转运过程，仍有待进一步研究，这为未来研究指明了方向。