基于DNAzyme激活的CRISPR/Cas系统实现铅污染的一锅式灵敏检测

作者及机构
本研究由四川大学化学工程学院的Ruijie Deng、Yaxuan Bai、Yumei Liu、Yunhao Lu、Zhifeng Zhao、Yi Deng及Hao Yang*（通讯作者）团队完成，发表于*Chem. Commun.*（2024年5月）。

学术背景

铅离子（Pb²⁺）污染是环境和食品安全领域的重大威胁，即使微量暴露也可导致神经损伤、心血管疾病等健康问题。目前，中国国家标准（GB 2762-2022）、世界卫生组织（WHO）和美国环保署（EPA）对饮用水中的Pb²⁺限值分别设定为48 nM、48 nM和72 nM。传统检测方法（如电感耦合等离子体质谱）依赖昂贵设备且操作复杂，而DNAzyme（脱氧核酶）虽具高特异性，但缺乏信号放大能力。CRISPR/Cas12a系统因其高催化效率（kcat/Km达10⁶–10⁹ s⁻¹ M⁻¹）和信号放大潜力，为提升DNAzyme检测灵敏度提供了新思路。然而，现有DNAzyme-CRISPR串联检测需分离步骤，难以实现均相反应。本研究开发了DZCas12T（DNAzyme-activated CRISPR/Cas12a tandem assay），通过延伸桥接策略实现一锅式检测，无需分离步骤。

研究流程与方法

1. 实验设计原理

DZCas12T的核心是三阶段级联反应：
- DNAzyme识别：Pb²⁺激活GR-5 DNAzyme，切割底物链（Sub）生成5′-片段（含2′,3′-环磷酸末端，RA>p）。
- 延伸桥接：T4 PNK将RA>p去磷酸化为RA-OH，随后通过Klenow聚合酶延伸合成双链CRISPR/Cas12a激活剂。
- CRISPR报告：激活的Cas12a切割荧光-淬灭标记的报告探针，释放荧光信号。

2. 关键实验步骤

• DNAzyme切割验证：通过电泳（图2b）和荧光分析（图2a）确认Pb²⁺依赖的底物切割效率。
  
• 延伸桥接优化：测试不同长度5′-片段（9 nt vs. 18 nt）作为引物的效率，18 nt片段信噪比（S/B）提高7.2倍（图3a）。
  
• 杂交臂长度筛选：7–7 bp的DNAzyme-底物杂交臂显示最高切割活性（S/B=11.59），过长或过短均降低效率（图3b）。
  
• gRNA设计：选用40% GC含量的gRNA-B（图3c）和30 bp激活剂长度（图3d），实现最大信号输出。
  

3. 性能测试

• 灵敏度：线性范围0–5 nM（回归方程y=946.08x+782.91，R²=0.9952），检测限（LOD）达27 pM（图4a）。
  
• 特异性：对Al³⁺、Cd²⁺等干扰离子的辨别因子（DF）为2.70–15.21（图4b）。
  
• 实际样本检测：在鸡蛋、饮用水等样品中加标回收率为87%–107%，相对标准偏差（RSD）<14.77%（图5）。
  

主要结果与逻辑关联

1. 延伸桥接的必要性：未加入T4 PNK或Klenow时荧光信号极低（图2a），证实延伸步骤是信号放大的关键。
   
2. 双信号放大机制：DNAzyme的多轮切割与CRISPR/Cas12a的 collateral cleavage 协同提升灵敏度。
   
3. 一锅式反应优势：传统方法依赖磁珠分离（表S2），而DZCas12T通过延伸桥接实现均相检测，简化流程。
   

结论与价值

1. 科学价值：首次将延伸桥接策略引入DNAzyme-CRISPR串联检测，解决了分离步骤的瓶颈问题。
   
2. 应用价值：可现场检测食品和环境中的Pb²⁺污染，满足EPA等机构的限值要求。
   
3. 技术突破：
   
   • 高灵敏度：27 pM的LOD优于多数DNAzyme方法（表S2）。
     
   • 高特异性：双识别（DNAzyme+CRISPR）确保抗干扰能力。
     
   • 操作简便：一锅式反应适合大规模筛查。
     

研究亮点

1. 创新方法：延伸桥接策略实现DNAzyme与CRISPR的无缝耦合。
   
2. 性能优越：灵敏度达pM级，且无需复杂设备。
   
3. 实际应用验证：在鸡蛋、河水等复杂基质中表现稳健。
   

其他价值

• 跨学科融合：结合DNAzyme的分子识别与CRISPR的信号放大，为重金属检测提供新范式。
  
• 扩展潜力：该策略可适配其他金属离子（如Hg²⁺、Cd²⁺）的检测体系。
  

（注：文中术语如DNAzyme（脱氧核酶）、CRISPR/Cas12a（规律间隔成簇短回文重复序列关联蛋白12a）等均保留英文原名，首次出现时标注中文。）