针对小分子与生物制药制剂中EDTA和DTPA测定的离子对高效液相色谱方法开发
本研究由来自美国百时美施贵宝公司（Bristol-Myers Squibb Company）新泽西州新不伦瑞克市分析及生物分析开发部门的George Wang与Frank P. Tomasella共同完成。该研究论文发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》期刊，于2016年1月21日在线发表。
学术背景 本研究属于药物分析化学领域，具体聚焦于药物制剂中痕量螯合剂的分析方法开发。在药品，尤其是液体制剂中，痕量重金属离子可能催化氧化等多种降解反应，从而损害产品质量、缩短货架期。氨基多羧酸类化合物（Aminopolycarboxylic acids， APCA）如乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）和二亚乙基三胺五乙酸（Diethylenetriaminepentaacetic acid， DTPA）是广泛使用的合成螯合剂，它们能与金属离子形成稳定络合物，从而“螯合”或“隔离”金属离子，使其失活，以此增强药品的稳定性。因此，在药品稳定性研究中，定量监测制剂中APCA的含量至关重要，以确保其维持在足以保护产品质量的水平。然而，EDTA和DTPA本身缺乏发色团，难以直接进行紫外（UV）检测，且药品基质中复杂的辅料成分可能产生干扰，这为分析方法开发带来了挑战。尽管已有多种技术（如气相色谱、离子色谱、毛细管电泳、液相色谱-质谱联用等）用于APCA分析，但考虑到方法的稳健性、操作简便性以及质量控制实验室的普及性，高效液相色谱法（HPLC）仍是优选。本研究旨在开发并验证两种“适用目的”的离子对反相高效液相色谱-紫外检测（Ion-pairing reversed-phase HPLC-UV）方法，分别用于定量测定小分子药物Abilify®（阿立哌唑口服溶液）中的EDTA，以及生物大分子药物Yervoy®（伊匹木单抗静脉注射液）中的DTPA。研究的核心目标是建立高灵敏度、高选择性、操作相对简便且适用于药品质量控制的分析方法。
详细工作流程 本研究包含两个相对独立但又基于相同原理的方法开发与验证流程，分别针对EDTA和DTPA。
1. 针对Abilify口服溶液中EDTA测定的方法开发与验证 * 研究对象与样品制备：研究对象为Abilify口服溶液商品制剂。其中活性药物成分为阿立哌唑，EDTA作为防腐剂添加浓度为0.5 mg/mL。样品制备过程巧妙地将螯合与稀释步骤合二为一：将口服溶液用含有1.6 mM Cu(NO₃)₂的稀释剂（水/乙腈=75:25， v/v）稀释10倍。此稀释剂中的Cu²⁺会与EDTA迅速形成EDTA-Cu²⁺金属络合物，该络合物在紫外区有较强吸收，从而解决了EDTA无发色团的问题。标准品溶液也使用相同稀释剂配制。制备好的溶液在分析前需在室温下静置至少30分钟以确保络合完全。 * 色谱条件开发与优化：采用Waters Alliance 2695 HPLC系统，配备2487 UV-Vis检测器，使用YMC Pack Pro C18柱（50 mm × 4.6 mm， 3 μm）。流动相A为24 mM四丁基氢氧化铵（Tetrabutylammonium hydroxide， TBA）磷酸盐缓冲液（pH 6.5），流动相B为乙腈。检测波长设为280 nm（EDTA-Cu²⁺络合物的最大吸收波长之一）。方法开发的关键挑战在于Abilify口服溶液基质复杂，含有保留行为差异极大的成分：EDTA-Cu²⁺（强极性，保留弱）、对羟基苯甲酸甲酯（methylparaben）和对羟基苯甲酸丙酯（propylparaben）（中等保留的防腐剂）以及高疏水性的阿立哌唑（强保留）。为同时分离这些成分，研究采用了梯度洗脱程序：初始25% B保持4分钟，随后在10分钟内线性升至65% B，然后在15分钟内返回至25% B，并平衡至20分钟。离子对试剂TBA的浓度优化是方法成功的关键。研究表明，在无TBA时，EDTA-Cu²⁺在溶剂前沿出峰。随着TBA浓度从8 mM增加至20 mM，EDTA-Cu²⁺的保留时间反而减少，这是因为溶液中离子强度增加，竞争性抑制了分析物与固定相的作用。在8 mM TBA时，EDTA-Cu²⁺与对羟基苯甲酸甲酯共流出；而当TBA浓度提高至24 mM时，两者实现了良好分离，且EDTA-Cu²⁺峰形更佳。因此，最终确定使用24 mM TBA缓冲液。梯度程序确保了所有关键组分（EDTA-Cu²⁺、两种防腐剂、阿立哌唑）在20分钟内完全分离。 * 方法验证：研究对该方法进行了全面的验证，包括： * 专属性：证明EDTA-Cu²⁺峰能与辅料峰、API峰及空白溶剂峰完全分离。 * 线性：在0.01至0.08 mg/mL浓度范围内（相当于标示量的20%-160%）线性良好，相关系数（r²）为0.9997。 * 重复性：三份样品制备的测定结果相对标准偏差（%RSD）为0.73%。 * 准确度：通过加标回收实验，平均回收率为101.0%，%RSD为0.55%。 * 灵敏度：定量限（LOQ）为4.5 μg/mL，检测限（LOD）为1.5 μg/mL。 * 溶液稳定性：标准品和样品溶液在室温、室内光条件下可稳定存放7天。
2. 针对Yervoy静脉注射液中DTPA测定的方法开发与验证 * 研究对象与样品制备：研究对象为Yervoy静脉注射液商品制剂。其中活性药物成分为单克隆抗体伊匹木单抗（约148 kDa），DTPA作为稳定剂添加浓度为0.0393 mg/mL。样品制备极为简单：取2 mL注射液于HPLC样品瓶中，加入20 μL 20 mM FeCl₃水溶液，涡旋混合至少1分钟。Fe³⁺与DTPA形成稳定的DTPA-Fe³⁺络合物，该络合物在260 nm处有紫外吸收。标准品溶液用水配制，并加入适量FeCl₃溶液。同样，溶液在分析前静置至少30分钟。 * 色谱条件开发与优化：使用与EDTA测定相同的HPLC系统和色谱柱。关键区别在于，由于伊匹木单抗分子量巨大，无法进入色谱柱填料孔径（100 Å），其在反相色谱条件下在死体积（void volume）处即被洗脱。这一发现使得样品无需进行复杂的蛋白沉淀前处理即可直接进样分析。研究采用了等度洗脱模式，流动相为24 mM TBA磷酸盐缓冲液（pH 6.5）与乙腈的混合液（80:20， v/v）。检测波长为260 nm（DTPA-Fe³⁺络合物的吸收波长）。在此条件下，伊匹木单抗在约1分钟出峰，而DTPA-Fe³⁺络合物在约3分钟出峰，两者分离良好。TBA浓度同样优化为24 mM以提供合适的保留和选择性。 * 方法验证：该方法也经过了系统验证： * 专属性：证明DTPA-Fe³⁺峰能与伊匹木单抗蛋白峰及空白溶剂峰完全分离。 * 线性：在0.01至0.08 mg/mL浓度范围内（相当于标示量的25%-200%）线性极佳，r²为1.000。 * 重复性：三份样品制备的测定结果%RSD为2.6%。 * 准确度：平均回收率为105.6%，%RSD为1.4%。 * 灵敏度：LOQ为5.4 μg/mL，LOD为1.8 μg/mL。 * 溶液稳定性：标准品和样品溶液在室温、室内光条件下可稳定存放24小时。
主要结果 1. 成功开发了两种基于离子对反相HPLC-UV的定量方法：一种采用梯度洗脱成功分离并定量了复杂小分子口服溶液中的EDTA；另一种采用等度洗脱成功实现了对单克隆抗体注射液中的DTPA的直接进样分析，无需去除蛋白。 2. 金属络合策略的有效性：使用Cu²⁺络合EDTA，使用Fe³⁺络合DTPA，成功将无紫外吸收的APCA转化为可被紫外检测的金属络合物，解决了检测灵敏度的核心问题。研究特别指出，选择Fe³⁺而非Cu²⁺用于DTPA，是因为DTPA-Fe³⁺的稳定常数（log K = 28.0）高于DTPA-Cu²⁺（log K = 21.4），能形成更稳定的络合物，从而获得更好的峰形。 3. 离子对试剂浓度优化的关键作用：研究详细探讨了TBA浓度对EDTA-Cu²⁺保留行为的影响，证明了通过调节离子对试剂浓度可以精细调控分析物的保留时间，从而解决与基质中共流出物的分离问题，这是方法选择性的重要保障。 4. 方法验证数据充分：两个方法均展示了良好的专属性、线性、精密度、准确度和足够的灵敏度，满足药物质量控制的要求。EDTA方法的溶液稳定性长达7天，而DTPA方法为24小时，这为实际样品测试提供了明确的指导。 5. 对单克隆抗体制剂直接分析的创新性应用：研究结果表明，由于单抗分子体积庞大，在所使用的色谱条件下不被保留，可直接在溶剂前沿洗脱而不干扰目标分析物。这简化了生物制剂中螯合剂分析的样品前处理流程。
结论 本研究成功开发并验证了两种“适用目的”的离子对反相HPLC-UV方法，用于定量测定小分子药物Abilify口服溶液中的EDTA和生物大分子药物Yervoy静脉注射液中的DTPA。方法的核心创新在于结合了金属离子络合增强紫外检测与离子对色谱增强保留的策略，从而实现了高灵敏度与高选择性。通过优化离子对试剂浓度和洗脱模式（梯度 vs. 等度），方法能够有效应对不同药物基质（小分子复方 vs. 生物大分子）带来的挑战。特别值得一提的是，针对单克隆抗体制剂，方法实现了无需蛋白沉淀的直接进样分析，大大简化了操作流程。这些方法稳健、可靠，已成功应用于相应药品中螯合剂含量的测定，为药品的稳定性研究和质量控制提供了有力的分析工具。
研究亮点 1. 策略创新性：将“金属络合增敏”与“离子对色谱增强保留/选择性”两种策略有机结合，系统性地解决了APCA在复杂药物基质中紫外检测弱和色谱保留差的难题。 2. 方法实用性：开发的方法基于常规的HPLC-UV仪器，无需昂贵的质谱检测器，易于在工业QC实验室推广。样品前处理简单，特别是对单抗制剂的分析步骤极为简便。 3. 系统性研究：不仅报告了最终方法，还详细阐述了方法开发过程中的关键考察点，如金属离子的选择依据（稳定常数）、离子对试剂浓度对保留和分离的影响机制，这对同行开发类似方法具有重要的指导价值。 4. 应用对象特殊：首次报道了通过直接进样HPLC分析单克隆抗体药物制剂中螯合剂（DTPA）的方法，为生物制药领域类似成分的分析提供了新思路。 5. 完整的验证：提供了符合药物分析要求的方法学验证数据，证明了方法的可靠性。
其他有价值的内容 研究在讨论部分对比了不同分析技术（GC、IC、CE、LC-MS）用于APCA分析的优缺点，突出了本研究所选HPLC-UV路径在兼顾灵敏度、选择性、稳健性与操作简便性方面的平衡。同时，文章引用了大量相关文献，为读者深入了解该领域提供了丰富的参考资料。作者也指出，虽然方法主要用于测定螯合剂，但其色谱条件理论上也具备同时分析制剂中其他成分（如防腐剂）的潜力，体现了方法的扩展性。